七氟烷后處理對非糖尿病及糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其與TOPK-PTEN-Akt通路的關(guān)系.pdf

1、第一部分 TOPK/PTEN/Akt通路在七氟烷后處理減輕心肌缺血再灌注損傷中的作用
　　目的：研究七氟烷后處理對心肌缺血再灌注或缺氧再復(fù)氧損傷的作用，并探討是否與TOPK/PTEN/Akt信號通路有關(guān)。
　　方法：雄性C57BL/6小鼠，15～16周齡，隨機分為五組：①假手術(shù)組（Sham）；②缺血再灌注損傷組（IR）；③七氟烷后處理組（Sevo-PostC）；④七氟烷后處理+LY294002組（Sevo-PostC+LY）

2、；⑤七氟烷后處理+HI TOPK-032組（Sevo-PostC+HI）。建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，即結(jié)扎冠脈左前降支后心肌缺血45分鐘并再灌注2小時，持續(xù)監(jiān)測小鼠血壓及心率。H9c2細胞使用含1000 mg/L葡萄糖的胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，隨后進行試驗，同樣隨機分為五組：①對照組（Control）；②缺氧再復(fù)氧損傷組（HR）；③七氟烷后處理組（Sevo-PostC）；④七氟烷后處理+LY294002組（Sevo-PostC+L

3、Y）；⑤七氟烷后處理+HI TOPK-032組（Sevo-PostC+HI）。H9c2細胞建立缺氧再復(fù)氧模型即細胞缺氧3小時再復(fù)氧6小時。TTC染色評估心肌梗死，MTT法評估細胞活性，ELISA法檢測肌酸激酶同工酶（CK-MB）和比色法檢測乳酸脫氫酶（LD H）的濃度，TUNEL法評估心肌細胞凋亡狀況，Western Blot檢測心肌組織或細胞蛋白TOPK、PTEN、Akt及其磷酸化水平。
　　結(jié)果：在動物水平，七氟烷后處理減輕了

4、心肌缺血再灌注的損傷，主要表現(xiàn)為提高小鼠再灌注末期平均動脈壓、減少心肌梗死面積、降低心肌酶CK-MB和LDH水平及減少心肌細胞的凋亡（與IR組比較，P＜0.05）。在細胞水平，七氟烷后處理提高了缺氧再復(fù)氧后的細胞活性，并減少了LDH的釋放（與HR組比較，P＜0.05）。然而，TOPK或 PI3K抑制劑可消除七氟烷后處理的心肌保護作用（P＜0.05）。與 IR或HR組比較，七氟烷后處理可明顯升高蛋白TOPK、PTEN及Akt的磷酸化水平（

5、P＜0.05）。七氟烷后處理給予 TOPK抑制劑后降低了 PTEN及 Akt的磷酸化水平（Sevo-PostC組與 Sevo-PostC+HI組，P＜0.05），而給予 PI3K抑制劑后僅減少了Akt的磷酸化水平（Sevo-PostC組與Sevo-PostC+LY組，P＜0.05）。
　　結(jié)論：七氟烷后處理能有效減輕小鼠心肌缺血再灌注的損傷，且該作用可能與TOPK/PTEN/Akt通路激活有關(guān)。
　　第二部分 TOPK/PT

6、EN/Akt通路受損在糖尿病消除七氟烷后處理心肌保護中的作用
　　目的：研究糖尿病對七氟烷后處理心肌保護作用的影響，并探討是否與TOPK/PTEN/Akt信號通路受損有關(guān)。
　　方法：7～8周齡雄性C57BL/6小鼠采用連續(xù)腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素5天建立糖尿病模型，記錄小鼠的飲食飲水量、體重及血糖變化。8周后，糖尿病和非糖尿病小鼠隨機分為四組：①缺血再灌注損傷組（IR）；②七氟烷后處理組（Sevo-PostC）；

7、③糖尿病缺血再灌注損傷組（Diabetic+IR）；④糖尿病七氟烷后處理組（Diabetic+Sevo-PostC）。H9c2細胞使用含1000 mg/L或4500 mg/L葡萄糖的胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，隨后進行試驗分組：①缺氧再復(fù)氧組（HR）；②七氟烷后處理組（Sevo-PostC）；③高糖缺氧再復(fù)氧組（HG+HR）④高糖七氟烷后處理組（HG+Sevo-PostC）；⑤載體腺病毒+高糖缺氧再復(fù)氧組（Ad-vector+HG+HR）；

8、⑥載體腺病毒+高糖七氟烷后處理組（Ad-vector+HG+Sevo-PostC）；⑦過表達 TOPK腺病毒+高糖缺氧再復(fù)氧組（Ad-TOPK+HG+HR）；⑧過表達TOPK腺病毒+高糖七氟烷后處理組（Ad-TOPK+HG+Sevo-PostC）。TTC染色評估心肌梗死，MTT法檢測細胞活性，ELISA法檢測肌酸激酶同工酶（CK-MB），比色法檢測乳酸脫氫酶（LDH）及丙二醛（MDA），羥胺法檢測總的超氧化物歧化酶（SOD）水平，TUN

9、EL法評估心肌細胞凋亡狀況，ROS探針評估心肌細胞的氧化應(yīng)激水平，Western Blot檢測心肌組織或細胞蛋白TOPK、PTEN、Akt及其磷酸化水平。
　　結(jié)果：在動物水平，糖尿病可加劇心肌缺血再灌注的損傷，主要表現(xiàn)為降低小鼠再灌注末期平均動脈壓、增加心肌梗死面積、提高心肌酶CK-MB和LDH的釋放、加劇心肌細胞的凋亡、增加心肌細胞的氧化應(yīng)激（Diabetic+IR及Diabetic+Sevo-PostC組與 IR組比較，P＜

10、0.05），同時，糖尿病也消除了七氟烷后處理的心肌保護作用（Diabetic+IR組與Diabetic+Sevo-PostC組比較，P＞0.05）。在細胞水平，高糖同樣加劇了心肌細胞缺氧再復(fù)氧的損傷，顯著降低了缺氧再復(fù)氧后的細胞活性、增加LDH的釋放及心肌細胞的氧化應(yīng)激（HG+HR及HG+Sevo-PostC組與HR組比較，P＜0.05），高糖同樣也消除了七氟烷后處理的心肌保護作用（HG+HR組與 HG+Sevo-PostC組比較，P＞

11、0.05）。但是，心肌細胞內(nèi)過表達TOPK后可明顯增加高糖刺激下缺氧再復(fù)氧后的細胞活性并減少 LDH的釋放（Ad-TOPK+HG+HR及Ad-TOPK+HG+Sevo-PostC組與Ad-vector+HG+HR組比較，P＜0.05）。糖尿病或高糖消除了七氟烷后處理誘導(dǎo)的蛋白 TOPK、PTEN及 Akt磷酸化升高的作用（Diabetic+Sevo-PostC組與 Diabetic+IR組比較，P＞0.05；HG+Sevo-PostC組

12、與HG+HR組比較，P＞0.05），同時也顯著減低了蛋白TOPK、PTEN及Akt的磷酸化（Diabetic+IR及 Diabetic+Sevo-PostC與 IR組比較，P＜0.05；HG+HR及HG+Sevo-PostC組與HR組比較，P＜0.05）。然而，心肌細胞內(nèi)過表達TOPK后可以顯著增加高糖刺激下 PTEN及 Akt的磷酸化（Ad-TOPK+HG+HR及 Ad-TOPK+HG+Sevo-PostC組與Ad-vector+HG