EPO與“腎精”相似性的體內(nèi)驗(yàn)證及“補(bǔ)腎益精”中藥健腦作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：補(bǔ)腎益精中藥治療腦部疾病是一個(gè)有效的方法，對(duì)于老齡化社會(huì)有獨(dú)特的價(jià)值和難以取代的優(yōu)勢(shì)。但是“腎精”具體是什么物質(zhì)，它又是如何發(fā)揮腦保護(hù)作用，目前還不清楚。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，EPO有類(lèi)似于腎精的作用，故提出EPO可能為“腎精”之一。前期研究發(fā)現(xiàn)腎虛大鼠腦內(nèi)EPO的表達(dá)量顯著下調(diào)，同時(shí)補(bǔ)腎藥右歸飲逆轉(zhuǎn)腎虛大鼠腦內(nèi)EPO表達(dá)量下調(diào)的作用，但在衰老模型上尚未進(jìn)行驗(yàn)證。本項(xiàng)研究受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81473549）、教育部博士點(diǎn)基

2、金博導(dǎo)類(lèi)（20110182110012）、重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技重大項(xiàng)目（渝中醫(yī)2010-1-4）資助。
　　目的：驗(yàn)證EPO與“腎精”的來(lái)源及作用的相似性，闡明“腎精”的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和“腎精通于腦”的生物學(xué)作用機(jī)制，為“補(bǔ)腎益精健腦”中藥的研發(fā)和篩選提供新的思路和方法。
　　方法：
　　1．衰老模型大鼠的建立與相關(guān)組織中EPO的表達(dá)變化
　　自然衰老大鼠模型的驗(yàn)證與相關(guān)組織中EPO的表達(dá)變化將SD大鼠分為2組

3、，青年組（2月齡，n=13）和自然衰老組（24月齡，n=13），觀(guān)察大鼠體重、皮毛的光潔程度，以曠場(chǎng)試驗(yàn)檢測(cè)大鼠的水平活動(dòng)度，測(cè)試盒檢測(cè)腦內(nèi)β-半乳糖苷酶、血清中SOD、MDA。Western Blot檢測(cè)衰老大鼠腦、腎、骨髓中EPO/EPOR的表達(dá)，ELISA檢測(cè)衰老大鼠外周血血清和骨髓上清中EPO的表達(dá)。
　　D-半乳糖衰老大鼠模型的建立以及腦組織中 EPO的表達(dá)變化取2月齡的SD雄性大鼠52只，體質(zhì)量為200±20g，按隨機(jī)

4、數(shù)字表隨機(jī)法分成空白對(duì)照組、50mg/kg、150mg/kg、250mg/kg D-半乳糖衰老組，每組13只。D-半乳糖衰老組依次皮下注射相應(yīng)濃度的等體積的D-半乳糖，空白對(duì)照組則皮下注射等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥八周，記錄大鼠體重、皮毛的光潔程度變化。水迷宮檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，其他檢測(cè)方法同上。
　　2.補(bǔ)腎藥的抗衰老作用及其對(duì)EPO表達(dá)變化的影響
　　補(bǔ)腎藥對(duì)自然衰老大鼠的抗衰老作用及其對(duì)EPO表達(dá)變化的影響取2

5、4月齡的SD雄性大鼠52只，體質(zhì)量500±50g，按隨機(jī)數(shù)字表法分成自然衰老模型組、右歸飲水提物（10g/kg）組、熟地黃水提物（4g/kg）組、制首烏水提物（2g/kg）組，每組13只，連續(xù)給藥4周，2月齡的SD雄性大鼠作為青年對(duì)照。記錄大鼠體重、皮毛的光澤程度。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的水平活動(dòng)度，測(cè)試盒檢測(cè)大鼠腦中β-半乳糖苷酶、SOD和MDA。Western Blot檢測(cè)大鼠腦、腎、骨髓中EPO/EPOR的表達(dá)，ELISA檢測(cè)衰老大鼠外

6、周血血清和骨髓上清中EPO的表達(dá)。
　　補(bǔ)腎藥對(duì)D-半乳糖衰老大鼠的抗衰老作用及其對(duì)EPO表達(dá)變化的影響取2月齡的雄性SD大鼠39只，體質(zhì)量200±20g，分空白對(duì)照組、150mg/kg D-半乳糖衰老組、熟地黃組，每組13只，D-半乳糖衰老組和熟地黃組頸背部皮下注射150mg/kg D-半乳糖，空白對(duì)照給予等體積的生理鹽水，連續(xù)8周，熟地黃組從第5周開(kāi)始，灌胃熟地黃水提物（4g/kg），連續(xù)給藥4周，其他組灌胃等體積的蒸餾水，檢

7、測(cè)指標(biāo)方法同上。
　　3.補(bǔ)腎藥“EPO樣”抗腦衰老作用及其分子作用機(jī)制研究
　　補(bǔ)腎藥“EPO樣”抗腦衰老作用取自然衰老大鼠實(shí)驗(yàn)中相關(guān)的大鼠組織，測(cè)試盒檢測(cè)大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)SOD活性和MDA的含量，TUNEL檢測(cè)腦細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，Western blot檢測(cè)大鼠海馬區(qū)caspase3的表達(dá)，采用VEGFR2和CD133雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量變化，采用VIII因子免疫熒光標(biāo)記腦組織中內(nèi)皮祖細(xì)胞，Wester

8、 Blot檢測(cè)腦組織中VEGFR2表達(dá)，觀(guān)察補(bǔ)腎藥類(lèi)似EPO的抗氧化、抗凋亡、促腦血管新生作用。
　　補(bǔ)腎藥腦保護(hù)的分子機(jī)制研究取自然衰老大鼠的腦組織蛋白，Wester Blot檢測(cè)腦組織中HIF-2α、p-AKT和p-STAT5的表達(dá)變化，分析補(bǔ)腎藥的腦保護(hù)作用的分子信號(hào)通路。
　　結(jié)果：
　　1.衰老模型大鼠的建立以及衰老大鼠相關(guān)組織中EPO表達(dá)的下調(diào)
　　自然衰老大鼠模型的建立以及誘導(dǎo)其相關(guān)組織中EPO的表

9、達(dá)下調(diào)與青年鼠相比，自然衰老大鼠皮毛粗糙發(fā)黃，自主活動(dòng)度顯著下降（P<0.05），腦內(nèi)衰老標(biāo)記物β-半乳糖苷酶顯著增多，血清中SOD活性顯著減弱，MDA含量顯著增多（均P<0.01），提示自然衰老大鼠模型成功。與青年鼠相比，自然衰老大鼠腎臟、骨髓細(xì)胞、腦內(nèi) EPO、EPOR的表達(dá)均顯著降低，外周血血清、骨髓上清液中分泌的EPO也有顯著降低（均P<0.05），提示衰老的同時(shí)，伴隨著腎臟、腦、骨髓以及外周血EPO的降低。
　　D-半乳

10、糖衰老大鼠模型的建立以及誘導(dǎo)腦組織中 EPO的表達(dá)下調(diào)與空白對(duì)照組相比，150mg/kg和250mg/kgD-半乳糖組大鼠皮毛發(fā)黃，水迷宮中潛伏期均顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)原位置次數(shù)顯著減少，同時(shí)腦內(nèi)衰老標(biāo)記物β-半乳糖苷酶含量顯著增多，血清中SOD活性顯著減弱，MDA含量顯著增多（均P<0.05），顯示造模成功。與空白對(duì)照組組比較，150mg/kg、250mg/kg D-半乳糖模型組腦內(nèi)EPO、EPOR的表達(dá)均顯著降低（P<0.05），提示

11、D-半乳糖致亞急性衰老大鼠伴隨腦內(nèi)EPO的降低。
　　2.補(bǔ)腎藥的抗衰老作用以及對(duì)大鼠相關(guān)組織中EPO含量的影響
　　補(bǔ)腎藥對(duì)自然衰老大鼠抗衰老作用及其對(duì)相關(guān)組織中EPO含量的影響與自然衰老大鼠相比，右歸飲組、熟地黃組、制首烏組大鼠腦內(nèi)β-半乳糖苷酶與，血清中SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著減少（均P<0.05），提示右歸飲、熟地黃、制首烏有抗氧化衰老作用。①與自然衰老大鼠相比，右歸飲、熟地黃、制首烏組可顯著增加腦內(nèi)海馬區(qū)

12、 EPO/EPOR的表達(dá)，降低腎臟組織中 EPO的表達(dá)（均P<0.05），但對(duì)腎臟和骨髓細(xì)胞中的EPOR的表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示補(bǔ)腎藥可促進(jìn)海馬區(qū)、腎臟中EPO表達(dá)。②與自然衰老大鼠相比，右歸飲、熟地黃可顯著性增加骨髓上清液和外周血清中EPO的表達(dá)（P<0.05），但制首烏對(duì)其表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示右歸飲、熟地黃促進(jìn)衰老大鼠骨髓和外周血中EPO的分泌。
　　熟地黃水提物對(duì)D-半乳糖衰老大鼠的

13、抗衰老作用及其對(duì)海馬區(qū)EPO表達(dá)量的影響①與D-半乳糖衰老大鼠相比，熟地黃水提物組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，穿越原平臺(tái)位置次數(shù)顯著增多，腦內(nèi)β-半乳糖苷酶含量與血清中MDA含量顯著減少，血清中SOD活性顯著增強(qiáng)（均P<0.05），提示熟地黃水提物抗衰老作用。②與D-半乳糖衰老大鼠相比，熟地黃水提物組腦內(nèi)EPO、EPOR的表達(dá)顯著增加（P<0.05），提示熟地黃水提物可促進(jìn)D-半乳糖衰老大鼠腦內(nèi)EPO、EPOR表達(dá)。
　　3.補(bǔ)腎藥的

14、“EPO樣”腦保護(hù)作用及其機(jī)制研究
　　補(bǔ)腎藥“EPO樣”腦保護(hù)作用與自然衰老組相比，補(bǔ)腎藥右歸飲、熟地黃、制首烏組腦組織中 SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著減少，腦細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著減少，海馬區(qū)Caspase3表達(dá)顯著降低，同時(shí)股骨骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，腦組織海馬區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，VEGFR2表達(dá)顯著增多（均P<0.05），提示補(bǔ)腎藥右歸飲、熟地黃、制首烏均有類(lèi)似EPO的抗氧化、抗腦凋亡以及促腦血管新生的作用。

15、
　　補(bǔ)腎藥腦保護(hù)作用分子機(jī)制研究與自然衰老大鼠相比，補(bǔ)腎藥右歸飲、熟地黃、制首烏組EPO上游調(diào)控因子 HIF-2α的表達(dá)均顯著增多，EPO下游蛋白p-STAT5表達(dá)也顯著增加（均P<0.05），而p-AKT變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示補(bǔ)腎藥有上調(diào)腦內(nèi)HIF-2α表達(dá)調(diào)控 EPO的生成以及通過(guò)增加EPO下游的STAT5表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　結(jié)論：EPO與衰老有著密切的關(guān)系，與“腎精”的變化以及腎精的功能有很大的