EPO促腦神經(jīng)血管單元細(xì)胞生長及補(bǔ)腎益精方藥促EPO生成作用研究.pdf

1、背景：中醫(yī)理論認(rèn)為，腎為先天之本?！澳I藏精”為代表的精氣學(xué)說是中醫(yī)藥學(xué)的重要基礎(chǔ)理論。腎所藏先天之精，主生長發(fā)育和生殖，是人體生長發(fā)育的根本；腎所藏后天之精，是維持生命的精微物質(zhì)，與人體生長壯老已過程密切相關(guān)。腎中精氣可以化髓，髓充于腦，“補(bǔ)腎益精健腦”是中醫(yī)治療衰老的經(jīng)典方法，療效獨特而顯著。中樞神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率日益漸長，臨床上通過補(bǔ)腎益精來治療腦部疾病的應(yīng)用將越來越多，而“腎精”的物質(zhì)基礎(chǔ)至今未明。
　　根據(jù)促紅細(xì)胞生成

2、素（EPO)的來源和作用，我們假設(shè)“EPO可能是‘腎精的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，EPO對腦細(xì)胞的保護(hù)和促進(jìn)作用可能是‘腎精通于腦’的生物學(xué)作用機(jī)制”。本研究擬采用課題組自主建立的大鼠3種腦細(xì)胞共培養(yǎng)的“腦神經(jīng)血管單元”體外模型和中藥血清藥理學(xué)的方法，觀察EPO對腦神經(jīng)細(xì)胞生長的促進(jìn)作用，以及補(bǔ)腎益精方藥對EPO生成和對腦神經(jīng)細(xì)胞生長的促進(jìn)作用，用以驗證其假說。本課題獲得了國家自然科學(xué)基金面上項目（81472549)、教育部博士點基金（20110

3、182110012)、重慶市衛(wèi)生局重大項目（渝中醫(yī)2010-1-4)的支持。
　　目的：觀察外源性EPO對腦神經(jīng)血管單元中細(xì)胞的促生長作用，以及補(bǔ)腎益精藥通過促EPO分泌而起到促進(jìn)腦神經(jīng)血管單元中細(xì)胞生長的作用，為EPO可能為腎精物質(zhì)基礎(chǔ)提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.腦血管神經(jīng)單元體外模型驗證EPO對腦細(xì)胞的促生長增殖作用在課題組前期建立的3種大鼠腦細(xì)胞共培養(yǎng)“腦神經(jīng)血管單”體外模型中，加入外源性EPO，設(shè)空白對

4、照，每組設(shè)6個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)，用MTT法分別測模型中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長曲線，流式檢測細(xì)胞生長周期，顯微鏡下微尺測量神經(jīng)元軸突長度，蛋白免疫印跡測定神經(jīng)元軸突生長蛋白GAP-43表達(dá)。
　　2.試驗用右歸飲、熟地黃、制首烏水煎液質(zhì)量控制
　　試驗用藥水煎液質(zhì)量控制:①右歸飲：馬錢苷含量測定色譜條件：色譜柱為ODS C18柱，流動相：乙腈：水（15:85)，檢測波長為240nm。肉桂醛含量檢測條件：色譜柱為OD

5、S C18柱，流動相為乙腈:水（35:65)，檢測波長為290nm,流速為1mL/min'柱溫30℃。毛蕊花糖苷含量測定條件：同熟地黃中。②熟地黃：毛蕊花糖苷含量測定條件：色譜柱為ODS C18柱，以（乙腈:0.1％醋酸=15:85)為流動相，檢測波長（334nm)，流速1mL/min_1，柱溫30℃。③制首烏：二苯乙稀苷含量測定色譜條件：色譜柱為ODS C18柱，以乙腈:水(20:80)為流動相；檢測波長320nm，流速為1mL/mi

6、n-1。
　　3.腦神經(jīng)血管單元模型驗證補(bǔ)腎益精方藥促EPO分泌和促腦細(xì)胞生長作用在上述3種腦細(xì)胞共培養(yǎng)的“腦神經(jīng)血管單元”體外模型上，分別加入大鼠含藥血清，設(shè)空白大鼠血清對照，取培養(yǎng)上清液，檢測EPO的分泌。分別提取模型中3種細(xì)胞蛋白，用WB方法檢測EPOR蛋白的表達(dá)。用MTT法分別檢測模型中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長曲線，BrdU標(biāo)記法檢測細(xì)胞生長狀況。
　　4.缺氧缺糖復(fù)氧損傷對腦神經(jīng)血管單元模型中EPO/E

7、POR表達(dá)影響及補(bǔ)腎益精方藥的保護(hù)作用在上述3種腦細(xì)胞共培養(yǎng)的“腦神經(jīng)血管單元”體外模型上，設(shè)正常培養(yǎng)組、缺氧缺糖/復(fù)氧組、空白大鼠血清+缺氧缺糖/復(fù)氧組、補(bǔ)腎益精方藥含藥血清+缺氧缺糖/復(fù)氧組，缺氧6h復(fù)氧12h損傷后，采用MTT法檢測細(xì)胞存活率，采用W B方法檢測三種細(xì)胞中EPO/EPOR蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.外源性EPO對神經(jīng)血管單元模型中神經(jīng)元軸突生長具有顯著促進(jìn)作用與空白對照組相比，外源性EPO12.5

8、U/mL組、25U/mL組神經(jīng)元軸突生長顯著增加，神經(jīng)元軸突生長蛋白GAP-43表達(dá)顯著增多（均P<0.05)。提示EPO能顯著促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長。
　　2.外源性EPO對腦神經(jīng)血管單元中星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的周期有顯著促進(jìn)作用與空白對照組相比，外源性EPO25U/mL組能顯著升高星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞的DNA合成期（S期）和DNA合成后期（G2)期細(xì)胞比例(P<0.05)。提示EPO能顯著促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞

9、增殖。
　　3.右歸飲、熟地黃及制首烏含藥血清能顯著促進(jìn)正常“腦神經(jīng)血管單元”中腦細(xì)胞生長并有促EPO分泌趨勢
　　3.1 補(bǔ)腎益精藥對正常腦神經(jīng)血管單元的細(xì)胞具有顯著促生長增殖的作用與5%空白大鼠血清組比較，5%右歸飲含藥血清組、5%制首烏含藥血清組和5%熟地黃含藥血清組在48h腦神經(jīng)血管單元模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加（P<0.05)。與10%空白大鼠血清組比較，10%右歸飲含藥血清組、10%制首烏含藥血清組和10%熟地黃

10、含藥血清組在48 h腦神經(jīng)血管單元模型中微血管內(nèi)皮細(xì)胞顯著增加(P<0.05)。表明補(bǔ)腎益精藥促進(jìn)腦神經(jīng)血管單元模型的星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
　　3.2 補(bǔ)腎益精藥有促進(jìn)正常腦神經(jīng)血管單元的細(xì)胞中EPO分泌及EPOR表達(dá)趨勢與空白血清對照組比，右歸飲、制首烏與熟地黃含藥血清均有促進(jìn)腦神經(jīng)血管單元模型中神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞EPO分泌增加和細(xì)胞中EPOR表達(dá)增加的趨勢，但差異均未達(dá)到顯著性意義（P>0.05

11、)。
　　4.補(bǔ)腎益精藥對腦神經(jīng)血管單元模型中三種細(xì)胞缺氧缺糖/復(fù)氧損傷具有顯著保護(hù)作用
　　4.1 補(bǔ)腎益精方藥能顯著提高缺氧缺糖/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率與正常組細(xì)胞相比，缺氧缺糖/復(fù)氧損傷模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01)，與模型組相比，5%空白大鼠血清組星形膠質(zhì)細(xì)胞，10%空白大鼠血清組微血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率均顯著升高（均P<0.01)。與5%空白血清組相比，缺氧缺糖/復(fù)氧損傷后5%右

12、歸飲含藥血清組、5%熟地黃含藥血清組星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率均顯著升高（均P<0.05)。與10%空白大鼠血清組相比，缺氧缺糖/復(fù)氧損傷后10%右歸飲含藥血清組、10%熟地黃含藥血清組微血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率均顯著升高（均P<0.05)。提示右歸飲、熟地黃提高缺氧缺糖/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率。
　　4.2 補(bǔ)腎藥對腦神經(jīng)血管單元模型中三種細(xì)胞缺氧缺糖/復(fù)氧損傷中EPO/EPOR表達(dá)影響與正常組相比較，缺氧缺糖/復(fù)氧損

13、傷后，三細(xì)胞共培養(yǎng)模型損傷組中神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中EPO/EPOR的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。與損傷模型組相比較，5%空白大鼠血清組3種細(xì)胞的EPO/EPOR的表達(dá)均顯著升高（均 P<0.05)。與5%空白血清組相比較，5%右歸飲含藥血清組、5%熟地黃含藥血清組三細(xì)胞共培養(yǎng)損傷模型中3種細(xì)胞EPO/EPOR的表達(dá)均顯著升高（均P<0.05)。與10%空白血清組相比較，10%右歸飲含藥血清組、10%熟地黃含藥血清

14、組三細(xì)胞共培養(yǎng)損傷模型中3種細(xì)胞的EPO/EPOR的表達(dá)均顯著升高（均P<0.05)。制首烏含藥血清未有顯著的提高三細(xì)胞共培養(yǎng)損傷模型中3種細(xì)胞EPO/EPOR的表達(dá)（均P>0.05)。提示右歸飲、熟地黃對缺氧缺糖/復(fù)氧損傷的腦神經(jīng)血管單元保護(hù)作用，其作用與增加EPO/EPOR的表達(dá)有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.外源性EPO對腦神經(jīng)血管單元模型中神經(jīng)元的軸突生長，星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用。
　　2

15、.右歸飲、熟地黃、制首烏對正常腦神經(jīng)血管單元中3種細(xì)胞具有促進(jìn)生長與增殖的作用，同時有促進(jìn)細(xì)胞分泌EPO和細(xì)胞中EPOR表達(dá)的趨勢。
　　3.右歸飲、熟地黃對缺氧缺糖/復(fù)氧損傷的腦神經(jīng)血管單元具有保護(hù)作用，其作用與增加EPO/EPOR的表達(dá)有關(guān)。
　　4.綜合考量外源性EPO與補(bǔ)腎益精方藥右歸飲、熟地黃、制首烏均具有促進(jìn)腦細(xì)胞生長增殖的作用，以及補(bǔ)腎益精方藥右歸飲、熟地黃還能顯著促進(jìn)腦組織細(xì)胞中EPO/EPOR表達(dá)，能初步證