EPO與腎虛大鼠腦組織神經(jīng)細胞的關系及右歸飲的保護作用研究.pdf

1、背景:“腎精”是中醫(yī)學特有的物質概念，是決定機體生長、發(fā)育、強壯、衰老、死亡的重要生命物質。“腎精通于腦”是中醫(yī)學重要理論?！把a腎益精健腦”是中醫(yī)重要治療法則，臨床應用非常廣泛。但“腎精”的物質基礎和“補腎益精健腦”機制至今未明。因此，在試驗研究中，“補腎益精健腦”藥效評價的動物模型、方法、技術、指標等體系無法建立。本項目提出有關“腎精”的假說，并擬采用體內、體外、生理、病理、藥物等多方面驗證“腎精”的物質基礎及作用機制。本項目的研究獲

2、得了重慶市衛(wèi)生局重大項目（渝中醫(yī)2010-1-4）、教育部博導基金(20110182110012)、國家自然科學基金面上項目(81473549)的資助。
　　目的:擬觀察大鼠腎虛模型、神經(jīng)細胞體外損傷模型與促紅細胞生成素(EPO)的關系，以及觀察外源性EPO和補腎經(jīng)典方右歸飲對上述模型的改善作用與EPO、EPOR的關系，驗證“EPO可能是‘腎精’物質基礎之一，EPO對大腦神經(jīng)細胞的促進和保護作用可能是‘腎精通于腦’的生物學機制之一

3、”的假說。
　　方法:
　　1.右歸飲煎劑主要成分含量測定:三種主要成分的含量測定方法的建立。馬錢苷含量測定色譜條件:色譜柱(ODS C18柱)，流動相:乙腈∶水(15∶85)，流速（1 mL·min-1），柱溫(30℃)，檢測波長為240nm;肉桂醛含量檢測條件:色譜柱（ODS C18柱），流動相（乙腈∶水=35∶65），流速(1 mL·min-1)，柱溫(30℃)，檢測波長（290nm）;梓醇含量測定條件:色譜柱(ODS

4、 C18柱），流動相（乙腈∶水=2∶98），流速（1mL·min-1），柱溫(30℃)，檢測波長(210 nm)。
　　2.腎虛大鼠腦組織EPO/EPOR變化及右歸飲的改善作用研究:60只雄性SD大鼠，隨機分為對照組、模型組、右歸飲5.86g·kg-1組、11.7g·kg-1組、23.4g·kg-1組，每組12只。除對照組以外，其余各組大鼠按10mg·kg-1腹腔注射氫化可的松，連續(xù)14d，復制腎虛模型。第15天，對照組、模型組灌

5、胃等體積的生理鹽水，其余各組按設定的藥物劑量進行灌胃，連續(xù)給藥14d。末次給藥4h后眼眶靜脈取血檢測生化指標以及促腎上腺皮質激素(ACTH)、睪酮(T)、T3、T4及促紅細胞生成素(EPO)的含量。取大鼠胸腺、腎上腺、睪丸稱重，計算臟器指數(shù)。取腦并分離出腦皮質區(qū)，蛋白印跡法檢測促紅細胞生成素(EPO)、促紅細胞生成素受體(EPOR)、Bcl-2、Bax蛋白表達。
　　3.D-半乳糖損傷對神經(jīng)細胞EPO/EPOR的影響及右歸飲的保護

6、作用研究:將高分化的PC12細胞分為6組:空白對照組、D-Gal損傷模型組、EPO+D-Gal組、右歸飲0.1 mg·mL-1+D-Gal組;0.2mg·mL-1+D-Gal組;0.4mg·mL-1+D-Gal組。對照組給予含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組給予10g·L-1的D-Gal處理24h，EPO+D-Gal組給予5IU·mL-1的EPO和D-Gal(10g·L-1)同時處理24h，右歸飲+D-Gal組分別采用3個劑量

7、和D-Gal同時處理24h。上述各組細胞加藥后于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育24h后，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞存活率，紅細胞生成素ELISA試劑盒檢測細胞上清液中EPO的含量，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western blot法檢測EPOR、EPO、Bax、Bcl-2等蛋白表達。
　　結果：
　　1.右歸飲煎劑主要成分含量測定結果
　　右歸飲煎劑中馬錢苷含量為0.341 mg·g-1;肉桂醛含量為0.0

8、39 mg·g-1;和梓醇含量為0.026 mg·g-1。
　　2.腎虛大鼠腦組織EPO/EPOR變化及右歸飲的改善作用研究結果
　　2.1腎虛大鼠血漿及腦組織EPO/EPOR顯著低于正常與對照組比較，模型組大鼠血漿中EPO含量顯著性降低;大鼠腦皮質區(qū)EPO、EPOR蛋白表達量顯著降低。
　　2.2右歸飲對腎虛大鼠血漿及腦組織EPO/EPOR降低具有顯著改善作用與模型組比較，右歸飲23.4 g·kg-1組、11.7g·

9、kg-1組、5.86 g·kg-1組大鼠血漿中EPO含量均顯著升高;右歸飲5.86g·kg-1組、11.7g·kg-1組大鼠大腦皮質中EPO和EPOR的表達水平均顯著升高;右歸飲23.4g·kg-1組腎虛大鼠大腦皮質中的EPOR表達量顯著升高，EPO有升高的趨勢。
　　2.3右歸飲對腎虛大鼠的虛弱狀態(tài)具有顯著改善作用
　　(1)改善行為體征:4組大鼠給予氫化可的松后精神萎靡，毛色變暗散亂，且活動量明顯減少，蜷縮扎堆，體重明顯

10、降低。藥物組灌胃右歸飲后，癥狀均有不同程度的改善，精神好轉，毛色逐漸光澤，活動量增多，體重逐漸回升。
　　(2)升高臟器指數(shù):與對照組比較，模型組胸腺指數(shù)、腎上腺指數(shù)、睪丸指數(shù)均顯著性降低，提示模型復制成功。與模型組比較，右歸飲23.4g·kg-1組胸腺指數(shù)、睪丸指數(shù)、腎上腺指數(shù)顯著升高。右歸飲5.86g·kg-1組、1.17 g·kg-1組胸腺指數(shù)、腎上腺指數(shù)、睪丸指數(shù)有升高的趨勢。
　　(3)升高血液生化指標:與對照組比

11、較，模型組RBC、HGB、PLT以及淋巴細胞數(shù)均顯著降低，WBC有下降的趨勢。與模型組比較，右歸飲23.4g·kg-1組、11.7g·kg-1組大鼠RBC、HGB、PLT以及淋巴細胞數(shù)均顯著升高。右歸飲23.4g·kg-1組還有WBC顯著升高。右歸飲5.86g·kg-1組僅有RBC顯著升高。
　　(4)升高血漿ACTH、T、T3、T4含量:與對照組比較，模型組血漿中ACTH、T、T3顯含量顯著性降低。與模型組比較，右歸飲23.4

12、g·kg-1組ACTH、T、T3含量顯著升高;右歸飲11.7 g·kg-1組、5.86 g·kg-1組T3的含量顯著升高，ACTH、T和T4含量有升高趨勢。
　　(5)升高大鼠腦皮質區(qū)抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比率(Bcl-2/Bax):與對照組比較，模型組大鼠腦皮質區(qū)抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下降，而促凋亡蛋白Bax表達水平顯著升高，Bcl-2/Bax比率顯著降低。與模型組比較，右歸飲5.86 g·kg-1組、11.7g·kg-1

13、組、23.4g·kg-1組大鼠大腦皮質中抗凋亡蛋白Bcl-2含量顯著升高，促凋亡蛋白Bax含量顯著降低，Bcl-2/Bax比率均顯著升高，提示右歸飲具有抗腎虛大鼠腦皮質細胞凋亡的作用。
　　3.D-半乳糖損傷對神經(jīng)細胞EPO/EPOR的影響及外源性EPO、右歸飲保護作用
　　3.1 D-半乳糖損傷導致神經(jīng)細胞EPO/EPOR顯著降低對照組神經(jīng)細胞培養(yǎng)上清液中EPO含量為1.55 IU/L，EPO、EPOR蛋白表達量相對IOD

14、分別為0.343、0.27。與對照組相比，D-半乳糖10g·L-1損傷模型組神經(jīng)細胞上清液中EPO含量為1.45 IU/L，EPO、EPOR表達量相對IOD分別為0.141、0.137，均顯著低于對照組。
　　3.2外源性EPO對D-半乳糖損傷的神經(jīng)細胞具有顯著促EPOR蛋白表達及細胞保護作用
　　(1)促進細胞中EPOR蛋白表達:對照組細胞中EPOR蛋白相對IOD值為0.27。與對照組相比，D-半乳糖損傷模型組細胞中EPO

15、R蛋白相對IOD為0.137，顯著低于對照組。與模型組相比，EPO+D-Gal組細胞中EPOR蛋白相對IOD為0.29，顯著高于模型組。提示外源性EPO能促進EPOR蛋白表達，有利于對損傷細胞的保護作用。
　　(2)提高細胞存活率:對照組細胞存活率為100％，與對照組相比，D-半乳糖損傷模型組細胞的存活率顯著降低至53.98±5.71％(P＜0.05)。與模型組相比，EPO+D-Gal組細胞存活率顯著提高到79.27±7.75％(

16、P＜0.05)。
　　(3)降低細胞凋亡率:對照組細胞凋亡率為8.1±2.2％。與對照組比較，D-半乳糖損傷模型組細胞凋亡率顯著升高至24.6±3.9％(P＜0.05)。與模型組相比，EPO+D-Gal組細胞凋亡率11.7±2.4％顯著低于模型組。與對照組比較，模型組抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白(Bcl-2/Bax)比率顯著性下降為0.21(P＜0.05)。與模型組比較，EPO+D-Gal組Bcl-2/Bax比率顯著升高至2.76(P＜

17、0.05)。
　　(4)促進細胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白表達:對照組細胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白相對IOD值分別為0.347、0.318。與對照組相比，模型組細胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白相對IOD值分別為0.161、0.129，顯著低于正常組。與模型組比較， EPO+D-Gal組細胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白相對IOD值分別為0.289、0.327，均顯著高于模型組，提示外源性EPO能

18、激活EPOR下游蛋白激酶的磷酸化，引起級聯(lián)反應，激活抗凋亡信號通路，有利于對損傷細胞的保護。
　　3.3右歸飲對D-半乳糖損傷的神經(jīng)細胞具有顯著促EPO、EPOR分泌作用及細胞保護作用
　　(1)促進EPO、EPOR分泌:與對照組相比，模型組細胞中EPO、EPOR表達均明顯下降;與模型組比較，右歸飲0.1 mg·mL-1+D-Gal組、0.2mg·mL-1+D-Gal組細胞中的EPO、EPOR表達水平顯著升高;右歸飲0.4m

19、g·mL-1+D-Gal組細胞中EPO含量顯著升高，EPOR無顯著變化。
　　(2)提高細胞存活率:與對照組相比，損傷模型組細胞的存活率顯著降至53.98±5.71％(P＜0.05);與模型組相比，右歸飲0.1mg·mL-1組、0.2mg·mL-1組、0.4mg·mL-1組細胞存活率分別是74.97±8.81％、76.21±5.28％、65.10±2.97％，均顯著升高。
　　(3)降低細胞凋亡率:對照組細胞凋亡率為8.1±

20、2.2％。與對照組比較，損傷模型組細胞凋亡率顯著升高至24.6±3.9％(P＜0.05)。與模型組相比，0.4mg·mL-1+D-Gal組、0.2mg·mL-1+D-Gal組細胞凋亡率分別為15.9±1.5％、14.3±1.7％，均顯著低于模型組。右歸飲0.1mg·mL-1+D-Gal組細胞凋亡率為17.8±3.1％有降低趨勢。與對照組比較，模型組抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白(Bcl-2/Bax)比率顯著性下降為0.21。與模型組比較，右歸飲

21、3個劑量組Bcl-2/Bax比率均顯著升高，分別達到2.43、1.41、0.94。
　　(4)促進細胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白表達對照組細胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白分別為0.347、0.318。與對照組相比，模型組細胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白分別為0.161、0.129，均顯著降低。與模型組比較，右歸飲0.2、0.4mg·mL-1+D-Gal兩個劑量組細胞中(p)Jak-2蛋白水平均顯著升高，分

22、別為0.276、0.299;(p)Akt的表達顯著升高，分別為0.299、0.308。右歸飲0.1mg·mL-1+D-Gal組有升高(p)Jak-2、(p)Akt趨勢為0.186，0.137(均P＞0.05)。提示右歸飲可能通過激活EPOR下游蛋白激酶的磷酸化級聯(lián)，激活抗凋亡信號通路蛋白表達，對損傷的神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用。
　　結論:
　　1.試驗用藥右歸飲水煎劑的主要成分含量馬錢苷0.341 mg·g-1，肉桂醛0.039

23、mg·g-1，梓醇0.026 mg·g-1，質量可控。
　　2.氫化可的松導致的大鼠腎虛模型，伴隨著血漿EPO和腦組織EPO、EPOR蛋白量顯著降低。
　　3.D-半乳糖導致的神經(jīng)細胞損傷，伴隨著細胞EPO分泌量及細胞EPO、EPOR蛋白表達量顯著降低。
　　4.外源性EPO對D-半乳糖損傷的神經(jīng)細胞具有顯著保護作用，能提高細胞存活率，降低細胞凋亡率，并伴隨著細胞中EPOR蛋白表達量顯著升高。
　　5.補腎經(jīng)典方

24、右歸飲對腎虛大鼠的衰弱狀態(tài)具有顯著的改善作用，能改善衰弱行為體征，升高衰弱臟器指數(shù)，升高血液RBC、HGB、PLT及淋巴細胞數(shù)量，升高血漿ACTH、T、T3含量，升高大鼠大腦皮質抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比率(Bcl-2/Bax)，并伴隨著血漿及腦組織中EPO、EPOR的降低被顯著逆轉。
　　6.補腎經(jīng)典方右歸飲對D-半乳糖損傷神經(jīng)細胞具有顯著保護作用，能提高細胞存活率，降低細胞凋亡率，并伴隨著細胞EPO分泌量及EPO、EPOR蛋白量