EPO與腎虛大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的關(guān)系及右歸飲的保護(hù)作用研究.pdf

1、背景:“腎精”是中醫(yī)學(xué)特有的物質(zhì)概念，是決定機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、強(qiáng)壯、衰老、死亡的重要生命物質(zhì)?！澳I精通于腦”是中醫(yī)學(xué)重要理論?！把a(bǔ)腎益精健腦”是中醫(yī)重要治療法則，臨床應(yīng)用非常廣泛。但“腎精”的物質(zhì)基礎(chǔ)和“補(bǔ)腎益精健腦”機(jī)制至今未明。因此，在試驗(yàn)研究中，“補(bǔ)腎益精健腦”藥效評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型、方法、技術(shù)、指標(biāo)等體系無(wú)法建立。本項(xiàng)目提出有關(guān)“腎精”的假說，并擬采用體內(nèi)、體外、生理、病理、藥物等多方面驗(yàn)證“腎精”的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。本項(xiàng)目的研究獲

2、得了重慶市衛(wèi)生局重大項(xiàng)目（渝中醫(yī)2010-1-4）、教育部博導(dǎo)基金(20110182110012)、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81473549)的資助。
　　目的:擬觀察大鼠腎虛模型、神經(jīng)細(xì)胞體外損傷模型與促紅細(xì)胞生成素(EPO)的關(guān)系，以及觀察外源性EPO和補(bǔ)腎經(jīng)典方右歸飲對(duì)上述模型的改善作用與EPO、EPOR的關(guān)系，驗(yàn)證“EPO可能是‘腎精’物質(zhì)基礎(chǔ)之一，EPO對(duì)大腦神經(jīng)細(xì)胞的促進(jìn)和保護(hù)作用可能是‘腎精通于腦’的生物學(xué)機(jī)制之一

3、”的假說。
　　方法:
　　1.右歸飲煎劑主要成分含量測(cè)定:三種主要成分的含量測(cè)定方法的建立。馬錢苷含量測(cè)定色譜條件:色譜柱(ODS C18柱)，流動(dòng)相:乙腈∶水(15∶85)，流速（1 mL·min-1），柱溫(30℃)，檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm;肉桂醛含量檢測(cè)條件:色譜柱（ODS C18柱），流動(dòng)相（乙腈∶水=35∶65），流速(1 mL·min-1)，柱溫(30℃)，檢測(cè)波長(zhǎng)（290nm）;梓醇含量測(cè)定條件:色譜柱(ODS

4、 C18柱），流動(dòng)相（乙腈∶水=2∶98），流速（1mL·min-1），柱溫(30℃)，檢測(cè)波長(zhǎng)(210 nm)。
　　2.腎虛大鼠腦組織EPO/EPOR變化及右歸飲的改善作用研究:60只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、右歸飲5.86g·kg-1組、11.7g·kg-1組、23.4g·kg-1組，每組12只。除對(duì)照組以外，其余各組大鼠按10mg·kg-1腹腔注射氫化可的松，連續(xù)14d，復(fù)制腎虛模型。第15天，對(duì)照組、模型組灌

5、胃等體積的生理鹽水，其余各組按設(shè)定的藥物劑量進(jìn)行灌胃，連續(xù)給藥14d。末次給藥4h后眼眶靜脈取血檢測(cè)生化指標(biāo)以及促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、睪酮(T)、T3、T4及促紅細(xì)胞生成素(EPO)的含量。取大鼠胸腺、腎上腺、睪丸稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。取腦并分離出腦皮質(zhì)區(qū)，蛋白印跡法檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素(EPO)、促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。
　　3.D-半乳糖損傷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞EPO/EPOR的影響及右歸飲的保護(hù)

6、作用研究:將高分化的PC12細(xì)胞分為6組:空白對(duì)照組、D-Gal損傷模型組、EPO+D-Gal組、右歸飲0.1 mg·mL-1+D-Gal組;0.2mg·mL-1+D-Gal組;0.4mg·mL-1+D-Gal組。對(duì)照組給予含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組給予10g·L-1的D-Gal處理24h，EPO+D-Gal組給予5IU·mL-1的EPO和D-Gal(10g·L-1)同時(shí)處理24h，右歸飲+D-Gal組分別采用3個(gè)劑量

7、和D-Gal同時(shí)處理24h。上述各組細(xì)胞加藥后于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育24h后，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率，紅細(xì)胞生成素ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中EPO的含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測(cè)EPOR、EPO、Bax、Bcl-2等蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.右歸飲煎劑主要成分含量測(cè)定結(jié)果
　　右歸飲煎劑中馬錢苷含量為0.341 mg·g-1;肉桂醛含量為0.0

8、39 mg·g-1;和梓醇含量為0.026 mg·g-1。
　　2.腎虛大鼠腦組織EPO/EPOR變化及右歸飲的改善作用研究結(jié)果
　　2.1腎虛大鼠血漿及腦組織EPO/EPOR顯著低于正常與對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿中EPO含量顯著性降低;大鼠腦皮質(zhì)區(qū)EPO、EPOR蛋白表達(dá)量顯著降低。
　　2.2右歸飲對(duì)腎虛大鼠血漿及腦組織EPO/EPOR降低具有顯著改善作用與模型組比較，右歸飲23.4 g·kg-1組、11.7g·

9、kg-1組、5.86 g·kg-1組大鼠血漿中EPO含量均顯著升高;右歸飲5.86g·kg-1組、11.7g·kg-1組大鼠大腦皮質(zhì)中EPO和EPOR的表達(dá)水平均顯著升高;右歸飲23.4g·kg-1組腎虛大鼠大腦皮質(zhì)中的EPOR表達(dá)量顯著升高，EPO有升高的趨勢(shì)。
　　2.3右歸飲對(duì)腎虛大鼠的虛弱狀態(tài)具有顯著改善作用
　　(1)改善行為體征:4組大鼠給予氫化可的松后精神萎靡，毛色變暗散亂，且活動(dòng)量明顯減少，蜷縮扎堆，體重明顯

10、降低。藥物組灌胃右歸飲后，癥狀均有不同程度的改善，精神好轉(zhuǎn)，毛色逐漸光澤，活動(dòng)量增多，體重逐漸回升。
　　(2)升高臟器指數(shù):與對(duì)照組比較，模型組胸腺指數(shù)、腎上腺指數(shù)、睪丸指數(shù)均顯著性降低，提示模型復(fù)制成功。與模型組比較，右歸飲23.4g·kg-1組胸腺指數(shù)、睪丸指數(shù)、腎上腺指數(shù)顯著升高。右歸飲5.86g·kg-1組、1.17 g·kg-1組胸腺指數(shù)、腎上腺指數(shù)、睪丸指數(shù)有升高的趨勢(shì)。
　　(3)升高血液生化指標(biāo):與對(duì)照組比

11、較，模型組RBC、HGB、PLT以及淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著降低，WBC有下降的趨勢(shì)。與模型組比較，右歸飲23.4g·kg-1組、11.7g·kg-1組大鼠RBC、HGB、PLT以及淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著升高。右歸飲23.4g·kg-1組還有WBC顯著升高。右歸飲5.86g·kg-1組僅有RBC顯著升高。
　　(4)升高血漿ACTH、T、T3、T4含量:與對(duì)照組比較，模型組血漿中ACTH、T、T3顯含量顯著性降低。與模型組比較，右歸飲23.4

12、g·kg-1組ACTH、T、T3含量顯著升高;右歸飲11.7 g·kg-1組、5.86 g·kg-1組T3的含量顯著升高，ACTH、T和T4含量有升高趨勢(shì)。
　　(5)升高大鼠腦皮質(zhì)區(qū)抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比率(Bcl-2/Bax):與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下降，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2/Bax比率顯著降低。與模型組比較，右歸飲5.86 g·kg-1組、11.7g·kg-1

13、組、23.4g·kg-1組大鼠大腦皮質(zhì)中抗凋亡蛋白Bcl-2含量顯著升高，促凋亡蛋白Bax含量顯著降低，Bcl-2/Bax比率均顯著升高，提示右歸飲具有抗腎虛大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用。
　　3.D-半乳糖損傷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞EPO/EPOR的影響及外源性EPO、右歸飲保護(hù)作用
　　3.1 D-半乳糖損傷導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞EPO/EPOR顯著降低對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中EPO含量為1.55 IU/L，EPO、EPOR蛋白表達(dá)量相對(duì)IOD

14、分別為0.343、0.27。與對(duì)照組相比，D-半乳糖10g·L-1損傷模型組神經(jīng)細(xì)胞上清液中EPO含量為1.45 IU/L，EPO、EPOR表達(dá)量相對(duì)IOD分別為0.141、0.137，均顯著低于對(duì)照組。
　　3.2外源性EPO對(duì)D-半乳糖損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有顯著促EPOR蛋白表達(dá)及細(xì)胞保護(hù)作用
　　(1)促進(jìn)細(xì)胞中EPOR蛋白表達(dá):對(duì)照組細(xì)胞中EPOR蛋白相對(duì)IOD值為0.27。與對(duì)照組相比，D-半乳糖損傷模型組細(xì)胞中EPO

15、R蛋白相對(duì)IOD為0.137，顯著低于對(duì)照組。與模型組相比，EPO+D-Gal組細(xì)胞中EPOR蛋白相對(duì)IOD為0.29，顯著高于模型組。提示外源性EPO能促進(jìn)EPOR蛋白表達(dá)，有利于對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　(2)提高細(xì)胞存活率:對(duì)照組細(xì)胞存活率為100％，與對(duì)照組相比，D-半乳糖損傷模型組細(xì)胞的存活率顯著降低至53.98±5.71％(P＜0.05)。與模型組相比，EPO+D-Gal組細(xì)胞存活率顯著提高到79.27±7.75％(

16、P＜0.05)。
　　(3)降低細(xì)胞凋亡率:對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為8.1±2.2％。與對(duì)照組比較，D-半乳糖損傷模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高至24.6±3.9％(P＜0.05)。與模型組相比，EPO+D-Gal組細(xì)胞凋亡率11.7±2.4％顯著低于模型組。與對(duì)照組比較，模型組抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白(Bcl-2/Bax)比率顯著性下降為0.21(P＜0.05)。與模型組比較，EPO+D-Gal組Bcl-2/Bax比率顯著升高至2.76(P＜

17、0.05)。
　　(4)促進(jìn)細(xì)胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白表達(dá):對(duì)照組細(xì)胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白相對(duì)IOD值分別為0.347、0.318。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白相對(duì)IOD值分別為0.161、0.129，顯著低于正常組。與模型組比較， EPO+D-Gal組細(xì)胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白相對(duì)IOD值分別為0.289、0.327，均顯著高于模型組，提示外源性EPO能

18、激活EPOR下游蛋白激酶的磷酸化，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活抗凋亡信號(hào)通路，有利于對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)。
　　3.3右歸飲對(duì)D-半乳糖損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有顯著促EPO、EPOR分泌作用及細(xì)胞保護(hù)作用
　　(1)促進(jìn)EPO、EPOR分泌:與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中EPO、EPOR表達(dá)均明顯下降;與模型組比較，右歸飲0.1 mg·mL-1+D-Gal組、0.2mg·mL-1+D-Gal組細(xì)胞中的EPO、EPOR表達(dá)水平顯著升高;右歸飲0.4m

19、g·mL-1+D-Gal組細(xì)胞中EPO含量顯著升高，EPOR無(wú)顯著變化。
　　(2)提高細(xì)胞存活率:與對(duì)照組相比，損傷模型組細(xì)胞的存活率顯著降至53.98±5.71％(P＜0.05);與模型組相比，右歸飲0.1mg·mL-1組、0.2mg·mL-1組、0.4mg·mL-1組細(xì)胞存活率分別是74.97±8.81％、76.21±5.28％、65.10±2.97％，均顯著升高。
　　(3)降低細(xì)胞凋亡率:對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為8.1±

20、2.2％。與對(duì)照組比較，損傷模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高至24.6±3.9％(P＜0.05)。與模型組相比，0.4mg·mL-1+D-Gal組、0.2mg·mL-1+D-Gal組細(xì)胞凋亡率分別為15.9±1.5％、14.3±1.7％，均顯著低于模型組。右歸飲0.1mg·mL-1+D-Gal組細(xì)胞凋亡率為17.8±3.1％有降低趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，模型組抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白(Bcl-2/Bax)比率顯著性下降為0.21。與模型組比較，右歸飲

21、3個(gè)劑量組Bcl-2/Bax比率均顯著升高，分別達(dá)到2.43、1.41、0.94。
　　(4)促進(jìn)細(xì)胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白表達(dá)對(duì)照組細(xì)胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白分別為0.347、0.318。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白分別為0.161、0.129，均顯著降低。與模型組比較，右歸飲0.2、0.4mg·mL-1+D-Gal兩個(gè)劑量組細(xì)胞中(p)Jak-2蛋白水平均顯著升高，分

22、別為0.276、0.299;(p)Akt的表達(dá)顯著升高，分別為0.299、0.308。右歸飲0.1mg·mL-1+D-Gal組有升高(p)Jak-2、(p)Akt趨勢(shì)為0.186，0.137(均P＞0.05)。提示右歸飲可能通過激活EPOR下游蛋白激酶的磷酸化級(jí)聯(lián)，激活抗凋亡信號(hào)通路蛋白表達(dá)，對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　1.試驗(yàn)用藥右歸飲水煎劑的主要成分含量馬錢苷0.341 mg·g-1，肉桂醛0.039

23、mg·g-1，梓醇0.026 mg·g-1，質(zhì)量可控。
　　2.氫化可的松導(dǎo)致的大鼠腎虛模型，伴隨著血漿EPO和腦組織EPO、EPOR蛋白量顯著降低。
　　3.D-半乳糖導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷，伴隨著細(xì)胞EPO分泌量及細(xì)胞EPO、EPOR蛋白表達(dá)量顯著降低。
　　4.外源性EPO對(duì)D-半乳糖損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用，能提高細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞凋亡率，并伴隨著細(xì)胞中EPOR蛋白表達(dá)量顯著升高。
　　5.補(bǔ)腎經(jīng)典方

24、右歸飲對(duì)腎虛大鼠的衰弱狀態(tài)具有顯著的改善作用，能改善衰弱行為體征，升高衰弱臟器指數(shù)，升高血液RBC、HGB、PLT及淋巴細(xì)胞數(shù)量，升高血漿ACTH、T、T3含量，升高大鼠大腦皮質(zhì)抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比率(Bcl-2/Bax)，并伴隨著血漿及腦組織中EPO、EPOR的降低被顯著逆轉(zhuǎn)。
　　6.補(bǔ)腎經(jīng)典方右歸飲對(duì)D-半乳糖損傷神經(jīng)細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用，能提高細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞凋亡率，并伴隨著細(xì)胞EPO分泌量及EPO、EPOR蛋白量