人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備與檢測(cè)及其在大鼠軟組織缺損模型中降解的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：⑴制備人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架并初步檢測(cè)其脫細(xì)胞效果、成分、機(jī)械性能等指標(biāo)；⑵探討人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（hADSCs）的生物相容性及其對(duì)hADSCs成脂分化能力的影響；⑶建立大鼠軟組織缺損模型，探討人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架于缺損軟組織模型內(nèi)生物降解性。
　　方法：①取正常脂肪組織約25g經(jīng)反復(fù)凍融、酶消化、有機(jī)溶劑提取脂質(zhì)、冷凍干燥等處理制備成人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架。大體觀察支架性狀，行HE、Mas

2、son染色、DAPI熒光染色觀察支架脫細(xì)胞效果；免疫組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)（Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白）保留情況；掃描電鏡觀察支架顯微結(jié)構(gòu)；萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)試支架機(jī)械性能；②利用酶消化法從人體健康脂肪組織中分離提取出hADSCs，擴(kuò)增培養(yǎng)、觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞免疫表型；定向誘導(dǎo)hADSCs成脂及成骨分化，油紅O、茜素紅染色鑒定；取第3代hADSCs與人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架復(fù)合培養(yǎng)，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；掃描電鏡觀察細(xì)胞粘附情

3、況并成脂誘導(dǎo)，14d后行細(xì)胞支架復(fù)合物冰凍切片，油紅O染色，RT-PCR檢測(cè)成脂特異性基因PPARγ、LPL mRNA表達(dá)情況；③取清潔級(jí)雌性Wistar大鼠18只，于左側(cè)背部切除豎脊肌部分肌肉，建立軟組織缺損模型，分別于4w、8w、12w觀察肌肉缺損愈合情況；另取清潔級(jí)雌性Wistar大鼠18只，于左側(cè)背部建立軟組織缺損模型，將支架植入其中；右側(cè)直接將支架植入皮下；分別于4w、8w、12w取出植入支架，大體觀察兩側(cè)支架降解情況，比較兩

4、組支架濕重，行HE染色觀察支架內(nèi)炎性浸潤(rùn)情況。
　　結(jié)果：⑴脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架呈海綿樣多孔結(jié)構(gòu)；HE及Masson染色未見明顯細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可見排列緊密的基質(zhì)蛋白；DAPI熒光染色未見明顯陽性細(xì)胞核，脫細(xì)胞徹底；免疫組織化學(xué)染色顯示支架材料Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白染色呈陽性結(jié)果；掃描電鏡觀察支架呈多孔泡沫樣結(jié)構(gòu)，孔隙相互連接，孔徑約50-60μm；萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)定支架最大載荷值低于脂肪組織；⑵膠原酶消化法可成功從脂肪組織中分離培

5、養(yǎng)出hADSCs，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，原代呈短梭形，傳代培養(yǎng)后呈長(zhǎng)梭形；流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型，其中CD44、CD90陽性，CD34、CD45陰性；hADSCs成脂、成骨定向誘導(dǎo)分化后，油紅O、茜素紅染色陽性。細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)后，CCK-8檢測(cè)顯示A值隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷升高，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，基質(zhì)支架對(duì)細(xì)胞無毒性；掃描電鏡可見大量細(xì)胞粘附于支架；成脂誘導(dǎo)支架細(xì)胞復(fù)合物，油紅O染色可見支架內(nèi)大量紅染脂滴；RT-PCR顯示LPL、PPARγmRNA顯著

6、高表達(dá)；⑶大鼠軟組織缺損模型建立后，分別于4w、8w、12w觀察可見軟組織缺損持續(xù)存在，未能自行填充修復(fù)；將支架植入組織缺損及皮下后分別于4w、8w、12w取材，可見植入組織缺損處支架及皮下支架表面皆形成包膜，通過大體觀察，比較濕重，可見缺損組支架降解明顯快于皮下組，HE染色缺損組支架炎性浸潤(rùn)明顯高于皮下組,兩組支架均未完全降解。
　　結(jié)論：①利用脫細(xì)胞技術(shù)制備的人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架脫細(xì)胞徹底，具有良好的三維空間結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外基