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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分 TUBB3在難治性癲癇患者及動(dòng)物模型中的表達(dá)
目的:檢測(cè) TUBB3在難治性癲癇患者及兩種慢性癲癇大鼠模型腦組織中的表達(dá)情況。
方法:
1.從課題組建立的由300多例難治性TLE患者術(shù)后腦組織組成的腦庫(kù)中隨機(jī)抽取癲癇腦組織標(biāo)本(實(shí)驗(yàn)組)30例,非癲癇腦外傷患者腦組織(顳葉皮質(zhì))標(biāo)本作為對(duì)照組10例。
2.成年雄性SD大鼠(體重220±20g,7-8周齡),氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射誘導(dǎo)癲癇
2、持續(xù)狀態(tài)(SE),構(gòu)建 SE后慢性 TLE模型,分為有自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作組(SRS,6w,n=8)和無(wú)自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作組(non-SRS,6w,n=8)。
3.構(gòu)建戊四氮(PTZ)慢性點(diǎn)燃大鼠模型,分為點(diǎn)燃成功組(n=8)和未點(diǎn)燃成功組(n=8)。
4.用免疫印跡方法檢測(cè)TUBB3表達(dá)情況,免疫熒光檢測(cè)TUBB3表達(dá)部位。
結(jié)果:
1.難治性TLE患者術(shù)后腦組織及對(duì)照腦組織中均有TUBB3表達(dá),
3、且TUBB3在癲癇患者術(shù)后腦組織中表達(dá)較對(duì)照組顯著增高(★p<0.05)。
2.在氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的慢性癲癇大鼠模型中,有自發(fā)性發(fā)作的大鼠皮質(zhì)和海馬 TUBB3表達(dá)水平均較無(wú)自發(fā)性發(fā)作組明顯增高(★★★p<0.001,#p<0.05);PTZ慢性點(diǎn)燃模型中,點(diǎn)燃成功組大鼠皮質(zhì)和海馬TUBB3表達(dá)水平均較未點(diǎn)燃組顯著增高(★p<0.05,##p<0.01)。
3.癲癇患者腦組織中免疫熒光顯示TUBB3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)
4、胞有較長(zhǎng)突起,主要在神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突初段表達(dá),且與抑制性神經(jīng)元標(biāo)記物(GAD67)和成熟的抑制性突觸標(biāo)記物(Gephyrin)共表達(dá),與興奮性突觸標(biāo)記物(PSD95)無(wú)共表達(dá);并在慢性癲癇大鼠模型腦組織中得到驗(yàn)證。
結(jié)論:
難治性TLE患者和兩種慢性癲癇大鼠模型腦組織中TUBB3表達(dá)均明顯增加,且TUBB3與抑制性突觸共表達(dá),提示TUBB3可能參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展。
第二部分 TUBB3對(duì)兩種癲癇動(dòng)物模型行
5、為學(xué)的影響
目的:為進(jìn)一步探討 TUBB3在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用,我們構(gòu)建了TUBB3-shRNA和TUBB3過(guò)表達(dá)基因的腺相關(guān)病毒(AAV)載體,通過(guò)海馬立體定位注射改變大鼠海馬TUBB3表達(dá),觀察TUBB3對(duì)PTZ慢性點(diǎn)燃模型和匹羅卡品慢性癲癇模型行為學(xué)的影響。
方法:
1.構(gòu)建攜帶有 TUBB3-shRNA和 TUBB3過(guò)表達(dá)基因的腺相關(guān)病毒載體。
2.成年雄性 SD大鼠隨機(jī)分為三組:海馬立
6、體定位注射腺相關(guān)病毒空載體組(AAV-GFP);腺相關(guān)病毒TUBB3-shRNA組(AAV-TUBB3-shRNA);腺相關(guān)病毒TUBB3過(guò)表達(dá)組(AAV-TUBB3)。
3.分別用免疫熒光、免疫印跡技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
4. PTZ慢性點(diǎn)燃模型行為學(xué)觀察:在沉默TUBB3和過(guò)表達(dá)TUBB3的癲癇模型中,我們利用閾下劑量PTZ,每隔48 h進(jìn)行1次,觀察點(diǎn)燃過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)平均發(fā)作分級(jí)。
5.氯化鋰-匹羅卡品癲
7、癇模型行為學(xué)觀察:在沉默 TUBB3和過(guò)表達(dá)TUBB3的癲癇模型中,造模后持續(xù)視頻監(jiān)測(cè)大鼠 SRS情況。統(tǒng)計(jì) SRS次數(shù)和用Racine評(píng)分評(píng)估發(fā)作的嚴(yán)重程度。
結(jié)果:
1. AAV-TUBB3-shRNA、AAV-TUBB3和AAV-GFP海馬立體定位注射后,免疫熒光結(jié)果顯示海馬CA1和齒狀回均有GFP陽(yáng)性表達(dá)。免疫印跡結(jié)果顯示,與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比,TUBB3-shRNA組OD值在病毒注射后第3周和第9周顯著降
8、低(★★P<0.01),TUBB3過(guò)表達(dá)組OD值在病毒注射后第3周和第9周顯著增加(★★P<0.01)。
2. PTZ慢性點(diǎn)燃過(guò)程中,與對(duì)照組相比,TUBB3-shRNA組各時(shí)間點(diǎn)平均發(fā)作分級(jí)顯著降低,TUBB3過(guò)表達(dá)組各時(shí)間點(diǎn)平均發(fā)作分級(jí)顯著升高(★P<0.05,★★P<0.01)。
3.氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的SE后慢性期內(nèi)(3-6 w),與對(duì)照組相比, TUBB3-shRNA組自發(fā)性發(fā)作次數(shù)和5級(jí)發(fā)作比例顯著降低
9、,TUBB3過(guò)表達(dá)組自發(fā)性發(fā)作次數(shù)和5級(jí)發(fā)作比例顯著升高(★P<0.05,★★P<0.01,★★★P<0.001)。
結(jié)論:
1.腺相關(guān)病毒TUBB3-shRNA或TUBB3過(guò)表達(dá)海馬立體定位注射后可顯著改變海馬TUBB3的表達(dá),轉(zhuǎn)染在注射后3周有效,可持續(xù)至9周。
2.腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的海馬TUBB3-shRNA能減輕PTZ慢性點(diǎn)燃過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)平均發(fā)作分級(jí),TUBB3過(guò)表達(dá)產(chǎn)生相反的結(jié)果。
3.
10、腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的海馬 TUBB3-shRNA能減少氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的慢性期自發(fā)性發(fā)作的次數(shù)并減輕發(fā)作嚴(yán)重程度,TUBB3過(guò)表達(dá)產(chǎn)生相反的結(jié)果。
第三部分 TUBB3在癲癇發(fā)作中的作用機(jī)制
目的:探討 TUBB3對(duì)點(diǎn)燃動(dòng)物神經(jīng)元抑制功能的影響及其可能的潛在機(jī)制。
方法:
1.取25只成年雄性清潔級(jí)SD大鼠,根據(jù)海馬內(nèi)立體定位注射試劑不同分為三組: AAV-TUBB3-sh組、AAV-TUBB3組
11、和AAV-GFP組。
2.三周后構(gòu)建PTZ慢性點(diǎn)燃大鼠模型,取材制作海馬腦片。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)各組海馬 CA1區(qū)錐體神經(jīng)元抑制性突觸后電流(mIPSC)和成對(duì)脈沖比例(PPR)的變化情況。
3.免疫印跡法檢測(cè) PTZ慢性點(diǎn)燃成功后大鼠海馬 GABA-A受體β2/3的總蛋白和膜蛋白表達(dá)情況。
4.免疫共沉淀檢測(cè)PTZ慢性點(diǎn)燃成功后大鼠海馬中TUBB3、GABARAP和 GABA-A受體β2/3三者相互
12、作用情況。
結(jié)果:
1.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)CA1區(qū)錐體神經(jīng)元記錄結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TUBB3-shRNA組中 mIPSC幅度顯著增高(★P<0.05);TUBB3過(guò)表達(dá)產(chǎn)生了相反的效果;mIPSC頻率在 TUBB3-shRNA組與 GFP組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05);TUBB3-shRNA組與 GFP組相比,PPR無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
2.免疫印跡結(jié)果顯示,TUBB3-shRNA組GA
13、BA-A受體β2/3膜蛋白/總蛋白比值顯著增加(★P<0.05),TUBB3過(guò)表達(dá)組膜蛋白/總蛋白比值明顯降低(★P<0.05);GABA-A受體總蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化(P>0.05);GluR2/3無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
3.免疫共沉淀結(jié)果顯示癲癇大鼠海馬組織中內(nèi)源性TUBB3和內(nèi)源性GABARAP、GABA-A受體三者相互作用。
結(jié)論:
1.癲癇大鼠海馬中下調(diào) TUBB3能顯著增加海馬 CA1區(qū)
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