2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
  癲癇的發(fā)病與SCN3A編碼的Nav1.3通道密切相關(guān)。Beckh等人在1989年已在小鼠身上中證實小鼠Scn3a(mScn3a)的表達(dá)主要發(fā)生在小鼠的幼年期,成年期幾乎沒有表達(dá)。在小鼠胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要經(jīng)Nav1.3通道來維持神經(jīng)細(xì)胞的興奮性,而在成年期小鼠主要以Nav1.1通道來維持神經(jīng)細(xì)胞的興奮性。在對癲癇的大量研究中,SCN3A突變導(dǎo)致癲癇只發(fā)現(xiàn)一種,然而研究發(fā)現(xiàn)SCN3A基因與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)。許多研

2、究證實不管是在原發(fā)性癲癇和繼發(fā)性癲癇中Ⅲ型納離子通道基因的表達(dá)均呈現(xiàn)為高水平,這可能是影響癲癇發(fā)病其中一個重要原因。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠癲癇的持續(xù)狀態(tài)中有許多基因的甲基化程度是下調(diào)的,也有一部分是上調(diào)的,而Scn3a的甲基化狀態(tài)改變及其如何起調(diào)控作用卻未清楚。
  研究目的:
  通過鑒定小鼠Scn3a基因啟動子上受CpG甲基化調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,分析這些元件與Scn3a基因時空表達(dá)的相關(guān)性;分析Scn3a基因啟動子上CpG位點甲

3、基化水平與癲癇發(fā)生的相關(guān)性;以期揭示CpG甲基化調(diào)控Scn3a基因表達(dá)的分子機制及其在癲癇發(fā)生中的作用,為癲癇的產(chǎn)前診斷及治療提供新的參考依據(jù)。
  研究方法:
  1.小鼠發(fā)育過程的分析
  1.1 采用生物信息學(xué)分析小鼠Scn3a核心啟動子上CpG位點的分析。
  1.2 采用PCR及熒光定量PCR進(jìn)行小鼠Scn3a mRNA水平的分析。
  1.3 采用重亞硫酸氫鹽(BSP法)對DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)換,再采用

4、直接測序法檢測DNA的甲基化程度。
  1.4 采用定點誘變的方法構(gòu)建突變表達(dá)載體,在N1E-115細(xì)胞中進(jìn)行雙熒光素酶報告基因活性檢測。
  1.5 采用EMSA實驗檢測Scn3a基因啟動子與細(xì)胞核蛋白之間體外的結(jié)合。
  1.6 采用染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測蛋白與DNA在組織和細(xì)胞中的結(jié)合情況。
  2.癲癇狀態(tài)下啟動子與蛋白結(jié)合的分析
  2.1 采用PCR及熒光定量PCR檢測各中樞型鈉離子通道及Mb

5、d2的mRNA水平。
  2.2 采用重亞硫酸氫鹽對DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)換,再采用直接測序法檢測DNA的甲基化程度。
  2.3 采用supershift-EMSA實驗檢測Scn3a可以結(jié)合何種蛋白。
  2.4 采用Western Blot方法檢測MBD2蛋白的表達(dá)水平。
  2.5 采用EMSA的方法檢測啟動子DNA與核蛋白的結(jié)合能力。
  2.6 采用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法檢測蛋白結(jié)合啟動子DNA的能力。

6、r>  研究結(jié)果:
  1.小鼠發(fā)育過程中Scn3a啟動子動態(tài)甲基化變化及MBD2蛋白參與Scn3a基因啟動子的作用
  小鼠Scn3a基因核心啟動子存在7個CpG位點,-39C位點發(fā)生甲基化的動態(tài)改變;-39C對熒光報告基因產(chǎn)生重要的影響,其甲基化的改變降低了熒光素報告基因的活性;-39C位點能募集細(xì)胞核蛋白結(jié)合到 Scn3a基因啟動子上影響 Scn3a基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá);Supershift-EMSA和染色質(zhì)免疫共沉淀證實

7、 MBD2能結(jié)合到 Scn3a啟動子上。
  2.癲癇小鼠Scn3a基因啟動子低甲基化及癲癇狀態(tài)下MBD2蛋白與啟動子的作用
  在癲癇小鼠各中樞型鈉離子通道中只有Scn3a的mRNA水平發(fā)生明顯改變;Scn3a基因啟動子中-39C甲基化發(fā)生低甲基化改變;在癲癇癇性發(fā)作中MBD2蛋白呈動態(tài)性變化,并通過作用于-39C CpG位點結(jié)合于小鼠Scn3a基因啟動子上;癲癇小鼠中MBD2結(jié)合Scn3a基因啟動子的能力減弱。
 

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