宮頸癌新輔助化療敏感性與PI3K-Akt通路基因多態(tài)性及癌組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)關(guān)系的研究.pdf

1、目的：新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）是局部晚期宮頸鱗癌治療非常重要的手段之一，宮頸鱗癌（squamous cervical cancer。SCC）細(xì)胞對(duì)NAC的敏感性是SCC治療成敗的關(guān)鍵因素。PI3K/Akt信號(hào)通路中基因多態(tài)性可能影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。本研究以接受鉑類藥物為基礎(chǔ)NAC的宮頸鱗癌患者為研究對(duì)象，通過(guò)分析比較 PI3K/Akt通路中基因多態(tài)性及癌組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)與宮頸鱗

2、癌NAC敏感性的關(guān)系，以期預(yù)測(cè)NAC療效相關(guān)的PI3K/Akt通路中基因多態(tài)性位點(diǎn)及蛋白標(biāo)志物。
　　方法：⑴選取FIGO（the Clinical International Federation of Gynecology and Obstetrics）臨床分期為 IB2-IIB接受以鉑類藥物為基礎(chǔ)的NAC治療至少兩個(gè)療程的SCC患者259例，化療結(jié)束后15天，根據(jù)WHO實(shí)體瘤近期療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)判定患者化療療效，其中NAC有效組

3、168例，NAC無(wú)效組91例。提取患者化療前全血基因組DNA并利用高通量Sequenom MassARRAY SNP基因型技術(shù)檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路中PIK3CA、Akt1、Akt2和PTEN基因中17個(gè) tagSNP的基因型，分析其等位基因和基因型的分布與NAC敏感性的關(guān)聯(lián)。⑵選取FIGO臨床分期為IB-IIA接受順鉑聯(lián)合紫杉醇化療至少兩個(gè)療程的SCC患者10例，根據(jù)WHO實(shí)體瘤近期療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為NAC有效組和無(wú)效組，

4、每組各5例。分別提取NAC有效組與NAC無(wú)效組中癌組織樣本的總蛋白，雙向凝膠電泳方法獲得兩組樣本差異表達(dá)蛋白質(zhì)圖譜，使用ImageMaster2D Platinum軟件比較分析圖譜中差異蛋白點(diǎn)，運(yùn)用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定表達(dá)差異蛋白質(zhì)。使用String在線軟件分析預(yù)測(cè)差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)David在線軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能富集分析。選取 ImageMaster2D Platinum軟件分析中差異表達(dá)倍數(shù)高的3個(gè)蛋白質(zhì)

5、，進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。
　　結(jié)果：①在局部晚期SCC患者中，PIK3CA基因rs3729679位點(diǎn)AG基因型攜帶者比AA基因型攜帶者化療耐藥風(fēng)險(xiǎn)明顯增高（P=0.022）。rs12494623位點(diǎn)中攜帶TC基因型患者比CC基因型攜帶者容易發(fā)生NAC耐藥（P=0.018）。Akt1基因中 rs2498786位點(diǎn) CG基因型攜帶者比 GG基因型攜帶者 NAC敏感性高（P=0.036）。Akt2基因中的rs10416620

6、和 rs62107593位點(diǎn) G等位基因（P=0.037）及 rs34716810位點(diǎn) A等位基因（P=0.037）可顯著降低 SCC患者NAC耐藥風(fēng)險(xiǎn)。并且發(fā)現(xiàn)Akt2基因中 rs892120位點(diǎn) G等位基因與SCC患者NAC敏感性增高有潛在關(guān)聯(lián)（P=0.045）。抑癌基因PTEN rs17431184位點(diǎn) CC基因型攜帶者呈現(xiàn)降低NAC耐藥的趨勢(shì)（P=0.061）。進(jìn)一步根據(jù)鉑類藥物不同分層分析后發(fā)現(xiàn)，在以順鉑為基礎(chǔ)的NAC化療方案

7、中PIK3CA基因rs3729679位點(diǎn)（P=0.010）和rs12494623位點(diǎn)（P=0.008）與SCC患者NAC低敏感具有顯著相關(guān)性。單倍型分析發(fā)現(xiàn)，Akt1基因中GGCC單倍型是SCC患者化療耐藥的危險(xiǎn)單倍型（P=0.018）。Akt2基因中低頻單倍型GGGGAG有保護(hù)作用，使SCC患者發(fā)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)降低（P=0.043）。②獲得了清晰、重復(fù)性好的NAC有效組和NAC無(wú)效組的雙向凝膠電泳圖譜。通過(guò)ImageMaster2D P

8、latinum軟件比較分析，發(fā)現(xiàn)兩組中顯著差異表達(dá)蛋白點(diǎn)共有72個(gè)（差異倍數(shù)在1.5倍以上，P<0.05）。其中與NAC有效組相比。NAC無(wú)效組中有37個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，35個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。選取其中差異表達(dá)倍數(shù)較高且圖像清晰的12個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。在NAC無(wú)效組中7種蛋白質(zhì)Tryptase beta-2、Stathmin1、Annexin A1、14-3-3σ、SCAA2、Hsp27和Hsp70表達(dá)上調(diào)；5種蛋白質(zhì)分別為Guanine

9、 nucleotide-binding protein subunit beta-2-like1、albumin、POTE ankyrin domain family member E、CapG和PKM2蛋白表達(dá)下調(diào)。將這12個(gè)差異蛋白進(jìn)行功能富集分析顯示，這些蛋白主要參與蛋白質(zhì)磷酸化、乙酰化修飾和細(xì)胞凋亡的功能調(diào)節(jié)。Western blot驗(yàn)證差異表達(dá)倍數(shù)顯著的3個(gè)蛋白質(zhì)，其表達(dá)差異情況與雙向電泳檢測(cè)結(jié)果一致：Hsp70和 Stath

10、min1在NAC無(wú)效組中表達(dá)高于NAC有效組，而PKM2在NAC無(wú)效組中低表達(dá)。
　　結(jié)論：⑴在局部晚期宮頸鱗癌患者中，PI3K/Akt信號(hào)通路中PIK3CA、Akt1和Akt2基因多態(tài)性與SCC患者NAC敏感性相關(guān)。rs3729679、rs12494623、rs2498786、rs10416620、rs62107593及rs34716810位點(diǎn)可成為預(yù)測(cè)宮頸鱗癌NAC療效的潛在分子指標(biāo)。⑵在順鉑為基礎(chǔ)的NAC療效不同的局部晚期S

11、CC患者中，Hsp70、Stathmin1、Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like1、PKM2和Tryptase beta-2可能通過(guò)蛋白磷酸化和乙?；揎椗cAnnexin A1、Hsp27及14-3-3σ共同作用參與抑制細(xì)胞凋亡，影響宮頸鱗癌細(xì)胞對(duì)順鉑為基礎(chǔ)的NAC敏感性。差異表達(dá)較為顯著的蛋白質(zhì)Hsp70、PKM2和Stathmin1有可能成為臨床預(yù)測(cè)SCC患者N