抑制肝臟TLR4介導(dǎo)的代謝性炎癥改善追趕生長(zhǎng)所致胰島素抵抗的研究.pdf

1、目的：
　　觀察追趕生長(zhǎng)導(dǎo)致胰島素抵抗的C57BL/6j小鼠肝臟TLR4介導(dǎo)的肝臟和系統(tǒng)性炎癥情況和肝臟自噬的改變，以及采用慢病毒包裝的siRNA選擇性下調(diào)肝臟TLR4基因表達(dá)對(duì)上述指標(biāo)的影響。
　　方法：
　　6周齡雄性C57BL/6j小鼠40只適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為普食組（n=10）和限食組(Restrict Diet, RD, n=30)。普食組給予普通飼料，開放飼喂16周作為對(duì)照（Normal Contro

2、l,NC）。RD組前4周給予普食組體重相匹配小鼠50％的食量，后給予高脂飼料開放飼喂8周。接著將RD組小鼠隨機(jī)分為追趕生長(zhǎng)組（Catch-Up Growth，CUG，n=10），追趕生長(zhǎng)TLR4-pLV干預(yù)組（Catch-Up Growth with TLR4-pLV intervention group，CUGT，n=10）和追趕生長(zhǎng)Cont-pLV干預(yù)組（Catch-Up Growth with Cont-pLV intervent

3、ion group, CUGC, n=10），繼續(xù)高脂飼喂4周并同時(shí)進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染干預(yù)。病毒滴度1×10^8Tu/ml，干預(yù)方式為尾靜脈注射，100ul/次/2周，共2次。RT-qPCR法評(píng)估TLR4-pLV抑制效率，檢測(cè)肝巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因（F4/80，Cd68，Cd11c）表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)肝巨噬細(xì)胞下游的主要炎癥通路IKKβ/NF-κB和JNK/AP-1活化情況，以及循環(huán)炎癥因子（TNF-α，IL-6）含量；免疫印跡法和 R

4、T-qPCR法聯(lián)合檢測(cè)肝組織自噬相關(guān)蛋白（LC3B，AMPK，mTOR）活化和基因（Beclin1，Atg7）表達(dá)水平；免疫印跡法檢測(cè)肝組織 Akt活化情況，生化法檢測(cè)血脂（FFA，TG，TC）水平，免疫組化法評(píng)估肝脂肪變性，動(dòng)態(tài)觀察糖耐量和系統(tǒng)性胰島素敏感性。
　　結(jié)果：
　　1、CUG小鼠肝臟和脂肪組織TLR4 mRNA表達(dá)量與NC組相比均異常增高（p<0.05），CUGT小鼠肝臟TLR4 mRNA表達(dá)量顯著低于CUG小

5、鼠（p<0.05），而脂肪組織TLR4 mRNA表達(dá)量與CUG小鼠比較并未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)改變，兩種組織中CUGC小鼠TLR4 mRNA表達(dá)量與CUG組相比均無明顯變化。
　　2、CUG與NC小鼠相比，肝組織巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因F4/80、Cd68表達(dá)水平明顯升高（p<0.01），巨噬細(xì)胞M1活化標(biāo)志基因Cd11c也明顯增高（p<0.05），CUGC小鼠呈現(xiàn)類似的變化，與CUG組相比各指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而CUGT組小鼠與CUG組相比上述指標(biāo)

6、均明顯回落（p<0.05）。CUG組小鼠NF-κB和AP-1活性均升高（p<0.01），而CUGT組與之相比，上述指標(biāo)均明顯降低（p<0.05）。同樣，CUG小鼠血清IL-6和TNF-α濃度均較NC組明顯升高，TLR4-pLV處理后能降低到與NC組相當(dāng)?shù)乃健?br>　　3、CUG組小鼠肝組織H&E染色呈現(xiàn)肝脂肪變性表現(xiàn)，同時(shí)肝臟TG沉積增加（p<0.01），與之相比，CUGC組無明顯差別，而CUGT組肝脂肪變性明顯改善，肝組織TG含量

7、顯著減少（p<0.01）。CUG組小鼠Akt活化較NC組減弱（p<0.01），CUGC組呈類似改變，而CUGT組小鼠Akt活化水平與上述兩組相比均明顯增強(qiáng)（p<0.05）。
　　4、與NC組相比，CUG組肝臟LC3-II/LC3-I比值明顯降低（p<0.01），Beclin1和Atg7基因表達(dá)均顯著下調(diào)，p-AMPK/AMPK比值下降達(dá)50%以下（p<0.01）， mTOR活化水平明顯升高（p<0.01）；而TLR4-pLV處理可

8、不同程度但是顯著逆轉(zhuǎn)上述改變，使各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)到與NC組沒有顯著性差異的水平。
　　5、RD組在限食過程中體重持續(xù)快速下降，而開放高脂飼喂1周內(nèi)體重急劇飆升至稍高于NC組的水平，此后以與NC組相當(dāng)?shù)乃俾势椒€(wěn)增長(zhǎng)。CUG組小鼠內(nèi)臟脂肪/體重比顯著升高（p<0.01）而皮下脂肪/體重比無明顯改變，CUGC組上述指標(biāo)變化與CUG組相一致，而與這兩組相比，CUGT組小鼠內(nèi)臟脂肪/體重比均顯著下降（p<0.05）。CUG組小鼠血清FFA、TG

9、、TC均顯著升高，與之相比，CUGT組上述指標(biāo)被不同程度但是顯著性降低。追趕生長(zhǎng)過程中限食可使糖耐量和胰島素敏感性一過性增強(qiáng)，而開放高脂飼喂后上述指標(biāo)均在4周內(nèi)急劇惡化，此后漸進(jìn)性發(fā)展。TLR4-pLV干預(yù)可使上述指標(biāo)均恢復(fù)到與NC組相當(dāng)?shù)乃健?br>　　結(jié)論：
　　追趕生長(zhǎng)小鼠在無明顯肥胖的情況下出現(xiàn)肝臟脂肪變性、內(nèi)臟脂肪沉積和胰島素抵抗等表型特征。TLR4-pLV干預(yù)可以靶向抑制肝臟TLR4基因表達(dá)，減少肝巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和M1