胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞在肝衰竭治療中的應(yīng)用及其代謝組學(xué)機制研究.pdf

1、研究背景：
　　急性肝功能哀竭(acute liver failure，ALF)是一類由各種原因引起的，以短期內(nèi)肝細(xì)胞大量壞死、進展迅速的肝性腦病和嚴(yán)重的肝功能損害為特征，并產(chǎn)生一系列并發(fā)癥的嚴(yán)重的肝功能障礙性疾病。發(fā)病率高，病死率更是高達(dá)70-80％，是目前醫(yī)學(xué)上最棘手的難題之一。近年，干細(xì)胞因其多向分化潛能，應(yīng)用于移植治療急性肝衰竭成為研究熱點。
　　干細(xì)胞在一定的內(nèi)環(huán)境下能夠定向分化為類肝細(xì)胞，分泌相關(guān)細(xì)胞因子，促進受

2、損肝臟的修復(fù)和再生。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，因其來源廣泛、具有高度的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，以及獨特的低免疫原性等而成為細(xì)胞移植合適的細(xì)胞源。骨髓來源的MSC是目前研究最為廣泛深入的種子細(xì)胞，但其受來源、MSC含量低等限制。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MSC還可來源于臍血、臍帶、脂肪和胎盤等多種組織。特別是胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human placental mesenchymal s

3、tem cells，hPMSCs)，和骨髓MSC有著極其一致的生物學(xué)特性，且免疫源性更低，增殖分化能力更強。同時胎盤在臨床上為廢棄物，取材幾乎不受限制，且不涉及倫理問題;因此，它不但能夠成為骨髓MSC的理想替代物，而且有更廣闊的應(yīng)用潛能。本研究擬分離、培養(yǎng)胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，并進行生物學(xué)特征鑒定。
　　ALF發(fā)病機制非常復(fù)雜，建立一個穩(wěn)定可靠的動物模型至關(guān)重要。目前國內(nèi)外研究肝損傷修復(fù)的模型大多采用小鼠、大鼠等嚙齒類動物，本研

4、究擬采用中國小型豬，利用半乳糖胺（D-galactosamine，GalN）誘導(dǎo)法建立穩(wěn)定的ALF動物模型，通過hPMSCs細(xì)胞移植來研究治療的可行性和安全性，并進行療效判斷。為hPMSCs移植治療肝衰竭的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　肝臟是人體重要的代謝器官，肝功能衰竭時血清中很多內(nèi)源性物質(zhì)的濃度會升高，如芳香族氨基酸、膽紅素、自由脂肪酸、血清氨、苯二氮卓類以及促炎癥細(xì)胞因子等。隨著病情的發(fā)展，體內(nèi)眾多內(nèi)源性代謝物的水平也在發(fā)生相

5、應(yīng)的變化。代謝組學(xué)是近年發(fā)展起來的一種系統(tǒng)生物學(xué)方法，能準(zhǔn)確而全面的測定生物體體液中小分子代謝物的變化，反映外界刺激或遺傳修飾下生物體的代謝應(yīng)答變化，其研究對象主要是相對分子質(zhì)量在1000以下的內(nèi)源性小分子代謝物。本研究將采用代謝組學(xué)手段，揭示在ALF病情發(fā)展和hPMSCs移植治療ALF的全過程中內(nèi)源性代謝物的動態(tài)變化模式，分析細(xì)胞移植治療對ALF代謝譜的影響;從代謝組學(xué)角度揭示細(xì)胞移植治療急性肝衰竭的分子機制。
　　方法：

6、>　　采用膠原酶消化、密度梯度離心法進行胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)，然后進行生物學(xué)特征鑒定，包括流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞表面標(biāo)志;成骨、成脂、成肝定向誘導(dǎo)分化;對體外誘導(dǎo)出的類肝細(xì)胞進行肝細(xì)胞功能測定。
　　采用頸靜脈注射半乳糖胺的方法建立中國小型豬ALF動物模型。造模后分為四組:A:無細(xì)胞移植組;B: hPMSCs通過頸靜脈途徑移植組;C:致死劑量X線照射的hPMSCs門靜脈途徑移植組;D: hPMSCs門靜脈途徑移植組。采集

7、移植前后外周血，肝穿和尸檢取肝組織，通過分析造模前后和不同移植途徑中國小型豬存活率、血清生化指標(biāo)、肝組織免疫組化染色和分子生物學(xué)測定，評價hPMSCs移植治療的合適途徑及療效。
　　采用基于超高效液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)（ultraperformance liquid chromatography combined with time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q/TOF-

8、MS)的代謝組學(xué)方法，對造模前后和細(xì)胞移植前后采集的血清進行代謝組學(xué)分析。用MarkerLynx XS(ver.4.1)(Waters Co.，Mil-ford，MA)和SIMCA-P+12.0(Umetrics AB，Sweden)等軟件進行多元統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　從胎盤中分離到的hPMSCs在體外可長期培養(yǎng)，高表達(dá)HLA-Ⅰ，CD29，CD73，CD13和CD90，幾乎不表達(dá)HLA-Ⅱ，CD45％，CD34，CD

9、133，CD31和CD79b，在體外能定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和有功能的類肝細(xì)胞。
　　多元統(tǒng)計分析結(jié)果顯示肝衰竭對照組與細(xì)胞移植組的代謝譜動態(tài)變化有顯著差別，模型豬的正常生理代謝被干擾，急性肝衰竭過程中出現(xiàn)明顯的代謝紊亂。甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)和芳香族氨基酸（AAA），在急性肝衰竭過程中含量明顯增加;與之相反是磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)和鞘磷脂(SM)在急性肝衰竭過程

10、中明顯下降。細(xì)胞經(jīng)門靜脈途徑移植后，模型豬肝臟功能顯著改善，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、膽堿酯酶(CHE)、總膽紅素(TBIL)和總膽汁酸(TBA)濃度逐漸恢復(fù)到正常范圍;細(xì)胞移植后，代謝紊亂得到緩解改善，代謝物最終接近正常對照組。從代謝軌跡分析得到的結(jié)果與從生化數(shù)據(jù)分析和組織學(xué)檢查所得到的結(jié)果相一致。同時，組化染色結(jié)果表明，肝臟炎癥反應(yīng)明顯改善，肝細(xì)胞變性和壞死得以緩解;而其他三組指標(biāo)改

11、變不明顯。門靜脈移植組與其他三組比較，7天存活率明顯延長并有顯著性差異。免疫組化和反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)結(jié)果表明門靜脈移植途徑動物肝臟中有人細(xì)胞的定植。
　　結(jié)論：
　　人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外都可以定向分化為有功能的類肝細(xì)胞，細(xì)胞移植后可顯著延長模型豬的存活時間。門靜脈移植途徑優(yōu)于頸靜脈移植。B超定位下的門靜脈移植hPMSCs可作為治療肝臟疾病的新手段。代謝組學(xué)可用于揭示hPMSCs移植后ALF恢