胎盤間充質干細胞在缺血性疾病中的治療及機制研究.pdf

1、第一部分胎盤間充質干細胞的提取、體外擴增培養(yǎng)和分化
　　目的：研究胎盤間充質干細胞提取方法、體外擴增培養(yǎng)和分化能力
　　方法：采用酶學組織消化法從足月產(chǎn)胎兒胎盤中分離、然后進行細胞培養(yǎng)擴增出胎盤間充質干細胞。在整個原代細胞和傳代培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)過程中，在顯微鏡下記錄觀察細胞生長，增殖情況及形態(tài)特征變化情況。流式細胞檢測胎盤間充質干細胞表面標志CD28，CD34，CD45，CD49b，CD73，CD90，CD105，HLA-DR

2、等。比較胎盤間充質干細胞的凍存和復蘇后細胞的形態(tài)學變化。通過特異誘導方式誘導胎盤間充質干細胞向成脂、成骨和新生血管誘導分化，并對分化后的細胞進行細胞類型鑒定。檢測胎盤間充質干細胞活力以及生長曲線檢測。
　　結果：原代細胞在培養(yǎng)到第三代時候，細胞呈形態(tài)均一的紡錘形，排列緊密，呈規(guī)則漩渦狀貼壁生長。細胞表型鑒定結果顯示：細胞表達CD10，CD29，CD44，CD49b，CD73；不表達CD34，CD45，HLA-DR。胎盤間充質干細胞

3、在特異的誘導下能向骨、脂肪和內皮細胞分化。通過分段降溫凍存復蘇后，胎盤間充質干細胞生物學特性仍保持穩(wěn)定，基本形態(tài)符合間充質干細胞的特點，仍具有向成骨細胞、脂肪細胞和內皮細胞分化的潛能。
　　結論：本實驗方法通過酶消化法成功的從胎盤中獲取了間充質干細胞，并通過細胞培養(yǎng)方法高效的擴增了目的細胞。獲取的細胞形態(tài)、功能穩(wěn)定。并成功的向骨、脂肪、內皮細胞誘導分化。分段降溫法保存胎盤間充質干細胞后，細胞復蘇后的形態(tài)、功能、生長能力和分化能力沒

4、有受到明顯影響。
　　第二部分胎盤間充質干細胞對下肢缺血性疾病的治療效果和機制研究
　　目的：胎盤間充質干細胞對下肢缺血性疾病的治療效果和機制研究
　　方法：模擬缺血缺氧環(huán)境，在體外低氧環(huán)境下培養(yǎng)胎盤間充質干細胞，評價其分化，和旁分泌細胞因子情況。體內實驗，采用CM-DIL標記胎盤間充質干細胞，建立小鼠下肢缺血模型后，缺血區(qū)域局部注射移植胎盤間充質干細胞。經(jīng)免疫組化、激光多普勒血流儀、下肢功能性檢測、炎癥因子、炎癥細胞

5、浸潤、抗凋亡蛋白、細胞因子和毛細血管密度測量，評價胎盤干細胞移植治療的療效。
　　結果：實驗證實低氧條件下，胎盤間充質干細胞旁分泌促進血管生成的活性細胞因子明顯增高，主要的細胞因子有血管內皮生長因子（VEGF），堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，胰島素樣生長因子-1（IGF-1）。轉化生長因子-β(TGF-β)和肝細胞生長因子(HGF)未發(fā)現(xiàn)明顯變化；移植的胎盤間充質干細胞注射移植到小鼠缺血下肢肌肉組織中，從下肢肌力、下肢血流、

6、下肢運動能力、下肢激光多普勒圖譜等方面的比較，均證實胎盤間充質干細胞對下肢缺血有保護作用。HE染色、免疫組化檢測的結果顯示，胎盤間充質干細胞能促進缺血區(qū)域血管的新生。對缺血組織中凋亡細胞、炎癥因子浸潤檢測也發(fā)現(xiàn)胎盤間充質干細胞能減少凋亡發(fā)生，降低炎癥因子的浸潤。Western-blot蛋白檢測結果顯示，胎盤間充質干細胞能明顯增加缺血組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。
　　結論：胎盤間充質干細胞在低氧環(huán)境中旁分泌促進血管生成的活性細

7、胞因子：VEGF，bFGF和IGF-1明顯增加。胎盤間充質干細胞治療缺血性下肢血管病變有效，其作用機制可能與其血管內皮細胞分化能力和自分泌/旁分泌促進血管生成的細胞因子有關，同時也能降低凋亡，降低炎癥因子浸潤。
　　第三部分胎盤間充質干細胞對心臟缺血性疾病的治療效果和機制研究
　　目的：胎盤間充質干細胞對心臟缺血性疾病的治療效果和機制研究
　　方法：建立小鼠心臟缺血模型后，在心臟局部缺血區(qū)域注射移植用生物膠包被的胎盤干

8、細胞，同時設置未治療心肌梗死組和單純生物膠治療組。心梗7天后經(jīng)心臟B超檢測心臟功能、用Pressure Volume系統(tǒng)對心臟實時壓力容積以及心率適應性功能性檢測、用Fluo-4AM對心肌細胞鈣離子超載檢測、TTC法進行心肌梗死面積檢測和Western-blot蛋白印記法檢測鈣離子相關蛋白表達水平，來評價胎盤干細胞移植治療的療效和具體機制。
　　結果：注射移植的胎盤間充質干細胞整合入小鼠缺血梗死區(qū)心肌組織，降低心肌梗死面積，提高心