基于干細(xì)胞的治療在缺血性心臟病中的應(yīng)用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分心臟干細(xì)胞模擬微粒的制備和鑒定
　　研究背景
　　目前干細(xì)胞移植為缺血性心臟病的治療提供新的方法。多種類型的成體干細(xì)胞，包括間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞在心肌梗死動(dòng)物模型中具有心臟修復(fù)作用。心臟肌球衍生干細(xì)胞（cardiosphere-derived stem cells, CSCs）是干細(xì)胞的一種，在心肌梗死動(dòng)物模型中表現(xiàn)出良好的心臟修復(fù)作用，目前已開展臨床I期和II期試驗(yàn)。研究表明CSCs的修

2、復(fù)機(jī)制主要為旁分泌機(jī)制，即通過分泌生長因子誘導(dǎo)心臟內(nèi)源性修復(fù)。雖然CSCs具有直接向心肌細(xì)胞分化的潛力，但是這種直接分化作用在CSCs的心臟修復(fù)作用中只起到微弱的作用。此外，CSCs的細(xì)胞膜在組織修復(fù)過程中起到至關(guān)重要的作用：注射的CSCs可以通過細(xì)胞間的相互接觸作用觸發(fā)宿主細(xì)胞的保護(hù)性/再生途徑。雖然干細(xì)胞治療缺血性心臟病已得到廣泛研究，但是目前干細(xì)胞移植存在的問題仍不可忽視：1）移植干細(xì)胞進(jìn)入宿主后的細(xì)胞分化，極易誘發(fā)腫瘤形成；2）

3、干細(xì)胞移植的免疫排斥反應(yīng)問題；3）干細(xì)胞來源有限，自體干細(xì)胞需要從患者自身提取，培養(yǎng)、鑒別和增殖等程序操作復(fù)雜、等待過程漫長；4）干細(xì)胞處理時(shí)極易出現(xiàn)變異，凍融時(shí)極易出現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)不穩(wěn)定或者細(xì)胞損傷等。生物材料的出現(xiàn)為改善干細(xì)胞移植的缺點(diǎn)提供可能性。
　　目的
　　本部分通過利用具有緩釋特性的可降解生物材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA）結(jié)合人CSCs的兩大關(guān)鍵功

4、能物質(zhì)-生長因子和細(xì)胞膜，制備出可模擬人 CSCs功能的細(xì)胞模擬微粒（ cell-mimicking microparticle, CMMP）。利用掃描電鏡和免疫熒光顯微鏡觀察CMMP的結(jié)構(gòu)特性；流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法等檢測CMMP的生物學(xué)特性。通過一系列的實(shí)驗(yàn)技術(shù)分析CMMP是否具備模擬CSCs的心臟保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)和功能。
　　方法
　　利用心肌組織標(biāo)本提取培養(yǎng)人CSCs，收集含有生長因子的條件培養(yǎng)液。凍融技術(shù)獲取人 C

5、SCs的細(xì)胞膜。通過水相/油相/水相的實(shí)驗(yàn)原理制備 CMMP：PLGA內(nèi)部包裹含有生長因子的條件培養(yǎng)液形成PLGA微粒，微粒外部被CSCs的細(xì)胞膜包被形成CMMP。根據(jù)PLGA是否包載生長因子或者包被細(xì)胞膜，制備3組不同的微粒。第一組（細(xì)胞模擬微粒組，CMMP組）：PLGA內(nèi)部包裹含有生長因子的條件培養(yǎng)液，外部包被CSCs的細(xì)胞膜；第二組（PLGA微粒組， Control MP1組）：PLGA內(nèi)部包裹含有生長因子的條件培養(yǎng)液形成PLGA

6、微粒；第三組（PLGA細(xì)胞膜組，Control MP2組）：PLGA外部直接包被細(xì)胞膜。通過掃描電鏡、免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA等方法分析探討CMMP的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。
　　結(jié)果
　　1.人CSCs提取和培養(yǎng)的各個(gè)細(xì)胞階段展現(xiàn)出不同的形態(tài)，制備CMMP所采用的CSCs為最終的干細(xì)胞形態(tài)即心臟肌球衍生干細(xì)胞。
　　2.電鏡圖片顯示CMMP和Control MP1的形態(tài)差異：CMMP外部有細(xì)胞膜包裹；定量分析顯

7、示ControlMP1、Control MP2、CMMP和CSCs的直徑未見明顯差異(P>0.05)。熒光顯微鏡下觀察到DiO標(biāo)記的CSCs細(xì)胞膜可以包被Texas red標(biāo)記的PLGA微粒；當(dāng)PLGA微粒和DiO染色劑共培養(yǎng)30min后，說明DiO染色劑并不會(huì)與PLGA微粒特異性結(jié)合。
　　3. CMMP特異性表達(dá)CSCs的細(xì)胞膜表面標(biāo)志物CD105和CD90，但是定量分析熒光強(qiáng)度顯示CSC細(xì)胞膜特異性結(jié)合CD105 PE或者C

8、D90 FITC的能力強(qiáng)于CMMP（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)Control MP2和CMMP特異性表達(dá)CSC的細(xì)胞膜表面標(biāo)志物CD105和CD90，但是Control MP1表面無CD105和CD90的表達(dá)。定量分析發(fā)現(xiàn)CMMP、CSC和Control MP2表達(dá)CSCs的細(xì)胞膜表面標(biāo)志物 CD105、CD90、CD45、CD34和 ckit的趨勢相同（P>0.05），說明CMMP和Control MP2已成功包被CSCs的細(xì)

9、胞膜，且制備過程和PLGA本身對于細(xì)胞膜表面標(biāo)志物的表達(dá)并無影響。
　　4.通過檢測CMMP和Control MP1在不同時(shí)間點(diǎn)（0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h）釋放的生長因子累計(jì)釋放百分比，發(fā)現(xiàn)PLGA具有明確的生長因子緩釋作用，細(xì)胞膜包裹并不影響 PLGA緩釋作用的發(fā)揮。ELISA法檢測CSCs和CMMP在0天、3天和5天的VEGF、IGF-1和HGF釋放水平，發(fā)現(xiàn)在0天時(shí)CSCs釋放的VE

10、GF、IGF-1和HGF水平明顯低于CMMP（P<0.05），在3天時(shí)CSCs和CMMP釋放生長因子水平并無明顯差異（P>0.05），在5天時(shí)CMMP釋放VEGF和IGF的水平明顯低于CSCs（P<0.05），HGF釋放水平在兩組之間并無明顯差異（P>0.05）。說明CMMP可以模擬CSCs釋放生長因子。
　　5.熒光顯微鏡下觀察到CMMP在凍融前和凍融處理后的形狀、直徑和熒光顯色并無明顯差異：CMMP均呈現(xiàn)圓形顆粒狀、直徑約20

11、μm、內(nèi)部PLGA微粒的Texas red熒光染色和外部的CSC細(xì)胞膜DiO染色依然清晰可見，并無明顯的破壞現(xiàn)象。CMMP在凍融前的直徑（20.00±2.55）μm和凍融后的直徑（21.07±2.10）μm之間并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn) CMMP特異性表達(dá)CD105和CD90并不受凍融的影響；定量分析發(fā)現(xiàn)CMMP的細(xì)胞表面標(biāo)記物CD105、CD90、CD45、CD34和ckit的表達(dá)水平在凍融前后并無明顯統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論
　　通過“水相/油相/水相”這一實(shí)驗(yàn)原理實(shí)現(xiàn)CMMP的制備，CMMP同時(shí)具備CSCs的細(xì)胞膜和生長因子。CMMP的制備過程和PLGA并不影響CMMP的細(xì)胞膜特異性表達(dá)表面分子標(biāo)記物，CMMP具有緩釋生長因子的能力。凍融操作對CMMP的結(jié)構(gòu)并無影響。CMMP具備模擬CSCs的心臟修復(fù)作用的潛力。
　　第二部分新型小鼠急性心肌梗死模型的制備
　　研究背景
　　缺血性心臟病是目

13、前威脅人類身體健康的主要心血管疾病之一，其主要病理生理變化為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成引起冠狀動(dòng)脈狹窄或者血栓形成引起冠狀動(dòng)脈閉塞，這一過程可引起急性心肌梗死（myocardial infarction, MI）發(fā)生。缺血引起心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆性損傷，梗死區(qū)內(nèi)殘余心肌細(xì)胞的增殖無法彌補(bǔ)缺血死亡的細(xì)胞，大量纖維組織增生形成瘢痕，心功能下降并逐步進(jìn)展為心力衰竭（heart failure, HF）。MI是導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率的心血管事件的主要

14、原因。建立MI病理模型是研究MI可能的治療靶點(diǎn)的重要方式。目前科研人員建立急性心肌梗死模型的主要方式為開胸、氣管插入并使用縫線永久性結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈（left anterior descending coronary artery, LAD）。近期Gao等的研究發(fā)現(xiàn)，采用“擠出心臟”的方式可以制備有效的小鼠急性MI模型，這一方法脫離氣管插入和呼吸機(jī)，在一定程度上解決小鼠MI模型的技術(shù)難題。但是“擠出心臟”方法對時(shí)間的要求非常高，縫線

15、結(jié)扎不僅增加心臟體外暴露時(shí)間，也是手術(shù)過程中耗時(shí)的重要組成部分。因此，如何采用有效的方法提高LAD結(jié)扎效率從而降低小鼠急性MI模型的死亡率是關(guān)鍵科學(xué)問題。
　　目的
　　本實(shí)驗(yàn)通過創(chuàng)新性使用外科手術(shù)夾（surgical clip, Clip）結(jié)扎LAD，觀察比較Clip結(jié)扎法與縫線結(jié)扎法的總手術(shù)時(shí)間、LAD結(jié)扎時(shí)間差異，小鼠的生存率差異，梗死區(qū)域炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡程度、心臟功能變化影響及兩種方法產(chǎn)生的梗死面積差異。旨在評估新

16、型小鼠急性心肌梗死模型的有效性和優(yōu)越性。
　　方法
　　所有動(dòng)物隨機(jī)分為三組：1）外科手術(shù)夾心肌梗死組（CMI組）；2）縫線心肌梗死組（SMI組）；3）假手術(shù)組（SHAM組）。采用CD1小鼠，給予3％異氟烷混合氧氣吸入麻醉，無機(jī)械通氣。仰臥位固定四肢于37℃遠(yuǎn)紅外恒溫墊上，胸骨正中處剪開皮膚，4-0絲線荷包縫合法預(yù)留。止血鉗鈍性分離皮下組織及肌肉，暴露第四肋間隙。止血鉗傾斜45°從第四肋間隙進(jìn)入胸腔，打開胸膜和心包后止血鉗輕

17、度張開，左手施力將心臟順利擠出。識別前降支走行范圍，用 Clip沿心臟長軸傾斜60°~90°結(jié)扎LAD。結(jié)扎后心臟立即推回胸腔內(nèi)，手指置于胸腔左右側(cè)擠壓胸腔排空空氣，迅速收緊預(yù)留于皮膚的縫線。術(shù)后，小鼠被放回籠中呼吸室內(nèi)空氣，并一直監(jiān)護(hù)至完全醒轉(zhuǎn)。采用“擠出心臟”和縫線結(jié)扎 LAD的方式制備 SMI組，并采用行開胸并“擠出心臟”但未結(jié)扎 LAD的小鼠作為SHAM組。心臟超聲檢測不同時(shí)間點(diǎn)心功能變化，免疫組織化學(xué)（Immunologica

18、l Histological Chemistry, IHC）染色法檢測炎癥反應(yīng)程度和細(xì)胞凋亡程度，TTC染色、HE染色和 Masson染色比較心肌梗死面積及纖維化程度，并進(jìn)行生存率和不同處理組手術(shù)時(shí)間的對比分析，評估新型小鼠急性心肌梗死模型的有效性和優(yōu)越性。
　　結(jié)果
　　1. SMI組手術(shù)時(shí)間耗時(shí)2.73±0.41 min，CMI組耗時(shí)2.52±0.42 min，SHAM組耗時(shí)2.41±0.02 min；縫線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的

19、時(shí)間大約是Clip方式的3倍(30.00±1.56 seconds vs10.50±1.09 seconds)。
　　2.在術(shù)后21天，SHAM組的生存率為89.5%，SMI組的生存率為51.35%， CMI組的生存率為74.2%。
　　3.超聲心動(dòng)圖發(fā)現(xiàn)手術(shù)后4小時(shí) SMI組和CMI組小鼠心臟的左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF）和左室短軸縮短率（left ven

20、tricular fraction shortening, LVFS）并無明顯差異（P>0.05），但是SHAM處理組的LVEF值和LVFS值明顯高于SMI組和CMI組（P<0.05）。手術(shù)后21天SHAM處理組的LVEF值和LVFS值明顯高于SMI組和CMI組（P<0.05），但是SMI組和CMI組之間的LVEF值和LVFS值并無明顯差異（P>0.05）。
　　4.相較于SHAM組，SMI組和CMI組梗死區(qū)域周圍CD68陽性的巨

21、噬細(xì)胞表達(dá)明顯增多（P<0.05），但是SMI組和CMI組梗死區(qū)域周圍CD68陽性的巨噬細(xì)胞表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。
　　5.相較于SHAM組，SMI組和CMI組梗死區(qū)域周圍TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞表達(dá)明顯增多（P<0.05），但是SMI組和CMI組梗死區(qū)域周圍TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。
　　6. TTC染色顯示SMI組和CMI組術(shù)后24小時(shí)相應(yīng)梗死區(qū)域心肌變白；HE染色發(fā)現(xiàn)手術(shù)21天后

22、SMI組和CMI組心肌梗死區(qū)域明顯纖維化；定量分析術(shù)后21天心臟冰凍切片Masson染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SMI組和CMI組的心臟梗死面積無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論
　　實(shí)驗(yàn)證明采用Clip結(jié)扎LAD是一種誘導(dǎo)小鼠急性心肌梗死模型的行之有效的方法，并且可以縮短手術(shù)時(shí)間和心臟在體外的暴露時(shí)間，提高手術(shù)后小鼠的生存率。Clip方法可以被應(yīng)用于小鼠急性心肌梗死模型的制備。
　　第三部分心臟干細(xì)胞模擬微粒在小鼠急性心肌梗死

23、模型中的修復(fù)作用及機(jī)制研究
　　研究背景
　　心血管疾病是世界范圍內(nèi)引起死亡的主要原因。治療缺血性心臟病的主要難題在于心肌損傷后心肌組織的再生能力差，即心肌缺血后發(fā)生不可逆的心肌細(xì)胞損傷、心肌組織難以耐受心肌缺血以及心臟自我修復(fù)能力差，最終導(dǎo)致心力衰竭。目前來說，可以根治缺血性心臟病或者心力衰竭的金標(biāo)準(zhǔn)是心臟移植。但是心臟移植受限于供體難以獲取。因此，尋找可以修復(fù)或者替代損傷心臟組織的方法仍然任務(wù)艱巨。干細(xì)胞移植的出現(xiàn)為心肌

24、細(xì)胞的再生提供希望，但是仍然受限于細(xì)胞移植后滯留率低、宿主免疫排斥等諸多缺點(diǎn)。以細(xì)胞為基礎(chǔ)結(jié)合生物材料的修復(fù)方式為心肌梗死的治療提供新的方法和希望。本論文的前期研究已經(jīng)證明心臟干細(xì)胞模擬微粒(cell-mimicking microparticle, CMMP)具有心臟肌球衍生干細(xì)胞（cardiosphere-derived stem cells, CSCs）的細(xì)胞膜和生長因子，并且可以在體外模擬CSCs表達(dá)細(xì)胞膜表面標(biāo)志物和緩慢釋放生

25、長因子。因此，研究CMMP如何模擬CSCs的心臟修復(fù)作用及相關(guān)機(jī)制是關(guān)鍵科學(xué)問題。
　　目的
　　本研究通過在體外獲取新生大鼠心肌細(xì)胞（ neonatal rat cardiomyocyte, NRCM），觀察CMMP對NRCMs的形態(tài)及活性影響等；通過制備小鼠急性心肌梗死模型，將CMMP直接注射到梗死區(qū)域周圍，通過多種實(shí)驗(yàn)方法觀察CMMP在心肌梗死后的心臟修復(fù)作用。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分析探討CMMP在心肌梗死中的治療潛力及優(yōu)越

26、性，為缺血性心臟病的治療提供新的方法。
　　方法
　　體外實(shí)驗(yàn)
　　通過將CMMP與NRCMs共培養(yǎng)，觀察NRCMs的細(xì)胞活性等指標(biāo)；用免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemical, ICC）染色法檢測NRCMs的增殖比率；Time Lapse觀察CMMP和NRCMs的搏動(dòng)性之間的關(guān)系。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　為了研究CMMP在體內(nèi)所引起的免疫排斥反應(yīng)程度，采用具有免疫能力的CD1小鼠，心肌注射CMMP或

27、者CSCs，7天后觀察心臟局部T細(xì)胞向注射CMMP和CSCs的區(qū)域滲透作用。
　　制備SCID小鼠急性心肌梗死模型，根據(jù)處理方式不同分為四組。第一組（對照組，Control組）在梗死區(qū)周圍直接心肌注射 PBS；第二組（PLGA微粒組， Control MP1組）在梗死區(qū)周圍直接注射PLGA微粒；第三組（細(xì)胞模擬微粒組， CMMP組）：在梗死區(qū)域周圍直接注射CMMP；第四組（細(xì)胞組，CSC組）：在梗死區(qū)域周圍直接注射 CSCs。免疫

28、組織化學(xué)(Immunological Histological Chemistry, IHC)染色法檢測心臟中的炎癥反應(yīng)變化、血管新生、心肌細(xì)胞再生、細(xì)胞凋亡等情況；超聲心動(dòng)圖檢測心臟功能變化；Masson染色檢測心臟形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果
　　體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.相較于NRCMs單獨(dú)培養(yǎng)組、Control MP2處理組和Control MP1處理組，與CMMP或者CSCs共培養(yǎng)的α-SA陽性NRCMs更多（P<0.

29、05），α-SA/ki67陽性的 NRCMs更多（P<0.05）。說明 CMMP可以和 CSCs一樣，增加共培養(yǎng)的NRCMs細(xì)胞活性，促進(jìn)更多的NRCMs進(jìn)入增殖周期。
　　2.相較于Control MP1處理組，大量的CMMP或者Control MP2可以圍繞在NRCMs周圍并接觸。
　　3. Time lapse顯示CMMP與直接接觸的搏動(dòng)NRCMs具有同步化運(yùn)動(dòng)的特性，CMMP具備圍繞心肌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的特性和朝向心肌細(xì)胞逐

30、漸運(yùn)動(dòng)的特性。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　4. CMMP和CSCs注射入CD1小鼠的心臟，7天后發(fā)現(xiàn)相較于CMMP處理組，注射CSCs的區(qū)域周圍有大量CD3和CD8陽性的T細(xì)胞聚集（P<0.05），這說明CMMP可以避免CSCs所誘導(dǎo)免疫T細(xì)胞的滲透。
　　5. CMMP注射入心肌后，在第1天和第3天主要滯留在心臟，在第7天少量CMMP隨著血液循環(huán)進(jìn)入肺臟和肝臟，在第28天心臟中的CMMP逐漸被完全代謝。
　　6.將

31、CMMP注入SCID小鼠心肌梗死的心臟后7天，相較于無CMMP區(qū)域， CMMP區(qū)域周圍TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞明顯減少（P<0.05）；CD45陽性的細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。CMMP具有抑制梗死心臟細(xì)胞凋亡的作用。
　　7.將 CMMP注入 SCID小鼠心肌梗死心臟后4周，相較于 Control組或者Control MP1處理組的心臟梗死區(qū)域周圍，α-SA陽性心肌細(xì)胞和α-SA/ki67陽性的心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增多（

32、P<0.05）；Lectin陽性的毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多（P<0.05）；新生的平滑肌血管密度明顯增高（P<0.05）。說明CMMP通過促進(jìn)心肌細(xì)胞再生，促進(jìn)局部血管新生，增大血流供應(yīng)的機(jī)制起到心臟保護(hù)作用。
　　8. Control組、Control MP1組、CMMP組和CSC組4周時(shí)Masson染色定量形態(tài)分析發(fā)現(xiàn)：相較于Control組和Control MP1組，CMMP處理組心臟修復(fù)作用最好，這一修復(fù)作用和CSCs處理組相

33、似：小鼠心肌梗死區(qū)域活性心肌細(xì)胞明顯增多（P<0.05）；梗死區(qū)域室壁厚度明顯增厚（P<0.05）；梗死面積明顯減少（P<0.05）。心臟超聲檢測評估左室射血分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn)，CMMP和CSCs處理組的心臟功能恢復(fù)明顯優(yōu)于Control組和Control MP1組（P<0.05）。CMMP可以在上述作用機(jī)制的基礎(chǔ)上可以改善心肌梗死后心臟功能，修復(fù)損傷心臟。
　　結(jié)論
　　CMMP可以在體外模擬CSCs促進(jìn)NRCMs活性和增殖性等細(xì)胞

34、活動(dòng)，在心肌梗死心臟中具備和CSCs類似的心臟修復(fù)作用：促進(jìn)心肌細(xì)胞再生、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞再生、增加新生血管形成，抑制梗死部位細(xì)胞凋亡，改善心肌梗死后心臟功能的作用。相較于CSCs，CMMP可以明顯避免CSCs移植會(huì)引起的T細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)，并且可以長期滯留在心臟中緩慢釋放生長因子。
　　第四部分心臟干細(xì)胞-P(NIPAM-AA)溫敏凝膠在小鼠急性心肌梗死模型中的修復(fù)作用及機(jī)制研究
　　近十年來不同類型的干細(xì)胞用來治療各種疾病

35、是研究熱點(diǎn)，部分類型的干細(xì)胞移植已經(jīng)開展臨床試驗(yàn)，但是其臨床應(yīng)用仍然受到細(xì)胞滯留率低、免疫排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的影響。
　　生物材料的出現(xiàn)為提高干細(xì)胞移植的效率提供科學(xué)依據(jù)。研究表明基于干細(xì)胞治療的修復(fù)方式為心肌梗死的治療提供新的方法和希望?；诟杉?xì)胞的治療方式主要包括兩種類型，一種為本論文前部分研究的以干細(xì)胞的功能物質(zhì)結(jié)合生物材料的方式進(jìn)行治療，另外一種為以干細(xì)胞自身結(jié)合生物材料的方式進(jìn)行治療。
　　許多天然的聚合物，例如纖

36、維蛋白膠、膠原質(zhì)、基質(zhì)膠、聚氨基葡萄糖、角蛋白和透明質(zhì)酸都已經(jīng)被用來注射進(jìn)入梗死心臟中改善梗死后心臟功能。這些可注射膠的共性包括良好的生物相容性，能促進(jìn)細(xì)胞分化、遷移和增殖，可以在一定程度上促進(jìn)心臟的修復(fù)。但是這些天然聚合物每個(gè)批次間差異性巨大、耗費(fèi)高，這些缺點(diǎn)阻礙了它們在臨床上的應(yīng)用。合成聚合物正在替代天然聚合物成為治療心肌梗死的新型材料。
　　在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目前比較引人注目的研究方法是將干細(xì)胞包裹在水凝膠中，將細(xì)胞-凝膠這一

37、復(fù)合體運(yùn)送到損傷組織，從而發(fā)揮干細(xì)胞的治療作用。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將人的心肌球衍生干細(xì)胞（cardiosphere-derived stem cells, CSCs）包裹在聚(Poly, P)N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸(N-isoproylacrylamine-co-acrylic acid, NIPAM-AA)溫敏凝膠中，作為一種可以不斷釋放生長因子的“生物膠囊”，探索其在小鼠急性心肌梗死模型中的治療作用及可能機(jī)制。
　　目的
　

38、　本部分通過體外合成P(NIPAM-AA)溫敏凝膠，分析P(NIPAM-AA)溫敏凝膠的結(jié)構(gòu)、物理特性、化學(xué)特性和生物相容性；CSCs與P(NIPAM-AA)溫敏凝膠共培養(yǎng)形成CSCs-P(NIPAM-AA)溫敏凝膠（簡稱細(xì)胞-凝膠），構(gòu)建小鼠急性心肌梗死模型，心肌注射細(xì)胞-凝膠，探討其對急性心肌梗死心臟的修復(fù)作用及機(jī)制。
　　方法
　　體外試驗(yàn)
　　體外合成P(NIPAM-AA)溫敏凝膠，與CSCs共培養(yǎng)后形成細(xì)胞-

39、凝膠。觀察CSCs或者新生大鼠心肌細(xì)胞（ Neonatal Rat Cardiomyocyte, NRCM）在P(NIPAM-AA)溫敏凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞活性和功能，明確P(NIPAM-AA)溫敏凝膠對細(xì)胞的生物相容性。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　CD1小鼠中心肌注射細(xì)胞-凝膠或者 CSCs，比較兩者所引起的宿主免疫排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)程度的不同。
　　制備CD1小鼠急性心肌梗死模型，根據(jù)處理方式不同分為四組。第一組（MI單獨(dú)處理

40、組，MI組）在梗死區(qū)周圍直接心肌注射PBS；第二組（凝膠組，MI+Gel組）在梗死區(qū)周圍直接注射溫敏凝膠；第三組（細(xì)胞-凝膠組，MI+hCSCs in Gel組）：在梗死區(qū)域周圍直接心肌注射 CSCs-P(NIPAM-AA)溫敏凝膠；第四組（細(xì)胞組，即 hCSC組）：在梗死區(qū)域周圍直接注射 CSCs。免疫組織化學(xué)(Immunological Histological Chemistry, IHC)染色法等檢測各個(gè)處理組3周后心臟修復(fù)狀況

41、，超聲心動(dòng)圖檢測心臟功能變化；Masson染色檢測心臟形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果
　　體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1. P(NIPAM-AA)凝膠具有溫敏性，電鏡圖片顯示結(jié)構(gòu)為蜂巢狀，孔間隙小于CSCs直徑，凝膠顆粒為納米級別。
　　2. P(NIPAM-AA)溫敏凝膠具有生物相容性：與CSCs共培養(yǎng)可見CSCs成團(tuán)生長，細(xì)胞的活性、增殖性和生長因子的分泌不受影響；與NRCMs共培養(yǎng)可見NRCMs成團(tuán)生長，細(xì)胞活性不受影響。
　　體

42、內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　3.在CD1小鼠心臟中心肌注射熒光標(biāo)記的細(xì)胞-凝膠或者人CSCs，熒光追蹤系統(tǒng)顯示7天后大量的細(xì)胞-微凝膠滯留在心臟；定量分析熒光強(qiáng)度顯示相比于CSCs單獨(dú)注射組，細(xì)胞-凝膠在心臟中的滯留率更高（P<0.05）。
　　4.在CD1小鼠心臟中心肌注射細(xì)胞-凝膠或者CSCs，7天后發(fā)現(xiàn)相較于細(xì)胞-凝膠注射心臟，大量CD3和CD8陽性的T細(xì)胞聚集在CSCs的周圍（P<0.05），這說明細(xì)胞-凝膠無明顯的誘導(dǎo)免疫T細(xì)

43、胞的滲透作用。
　　5.小鼠炎癥抗體陣列 C1提示相較于細(xì)胞-凝膠注射小鼠，注射 CSCs的小鼠血漿有大量的炎癥因子高水平表達(dá)。
　　6.相較于凝膠注射組，將細(xì)胞-凝膠注射入小鼠心肌梗死心臟中3周，細(xì)胞-凝膠可以明顯抑制梗死心臟的 TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞表達(dá)（P<0.05）；促進(jìn)α-SA陽性心肌細(xì)胞和α-SA/ki67陽性的心肌細(xì)胞表達(dá)增多（P<0.05）；促進(jìn)vWF陽性的毛細(xì)血管數(shù)量增多（P<0.05）。說明細(xì)胞-凝膠可

44、以促進(jìn)心臟內(nèi)源性修復(fù)，即促進(jìn)心肌細(xì)胞再生和增殖、血管新生。
　　7. Masson染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞-凝膠在小鼠心肌梗死心臟中具有明顯的心臟保護(hù)作用：相較于MI組、凝膠注射組和細(xì)胞組，3周后細(xì)胞-凝膠組梗死區(qū)域的存活心肌最多、梗死面積最少和梗死壁最厚（P<0.05）。
　　8.心功能分析發(fā)現(xiàn)各個(gè)處理組在手術(shù)后4小時(shí)的左室射血分?jǐn)?shù)值并無明顯差異（P>0.05），3周后 MI組和細(xì)胞組的左室射血分?jǐn)?shù)值明顯下降，凝膠注射組和細(xì)胞-凝膠處

45、理組的心功能均有一定程度的改善，但是細(xì)胞-凝膠組的左室射血分?jǐn)?shù)值明顯高于凝膠注射組（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　作為基于干細(xì)胞治療方式的一種，本實(shí)驗(yàn)證明人工合成膠可以作為細(xì)胞的載體結(jié)合CSCs，并促進(jìn)CSCs在心肌梗死心臟中的心臟修復(fù)作用。將CSCs包裹在 P(NIPAM-AA)溫敏凝膠中一定程度上可以保護(hù)細(xì)胞免受宿主的免疫細(xì)胞攻擊，另一方面干細(xì)胞分泌的生長因子可以通過溫敏膠的多孔狀結(jié)構(gòu)釋放到損傷心臟促進(jìn)心臟修復(fù)。因此，