Ph樣ALL體外藥敏篩選方法的建立及初步臨床應用研究.pdf

1、目的：建立體外酪氨酸激酶抑制劑藥敏篩選系統(tǒng)，探討在體外篩選Ph樣ALL的方法，幫助臨床進行更精確的急性淋巴細胞白血?。ˋLL）危險度分層，使患者獲益有效的靶向治療藥物，提高患者的緩解率及改善預后。
　　方法：
　　1.首先用Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)法檢測并描繪細胞活力曲線，檢測不同濃度酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼作用于BCR-ABL陽性的人急性白血病細胞系K562、BV173和NUP214-ABL

2、1融合基因陽性的人急性白血病細胞系SIL-ALL及人類急性白血病細胞系697、NALM6、SHI-1、HL-6024小時后的增殖抑制作用。
　　2.采用密度梯度離心法分離初診急性白血病患者骨髓液標本單個核細胞，并用CCK-8法檢測不同濃度酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼作用114例不同初治急性白血病類型的原代新鮮白血病細胞72小時后的增殖抑制作用。結合急性白血病患者細胞及分子遺傳學特點進行分析預測。
　　3.用SPSS22．0統(tǒng)計軟

3、件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用三次獨立實驗的平均值表示，實驗結果用均數(shù)±標準差的形式呈現(xiàn)。細胞活性的組間差異使用student’s t-test或者two-way ANOVA檢驗方法。所有分析的方法均采用雙邊分析方法，并且P<0.05(*)，P<0.01(**),P<0.001(***)認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.K562、BV173和SIL-ALL的平均細胞活性高于697、NALM6、SHI-1、HL-60細

4、胞系平均細胞活性的40％～60%，差異具有統(tǒng)計學意義。并且K562、BV173、SIL-ALL三者的細胞活性都隨著藥物濃度的增加而降低。
　　2.用苔盼藍拒染試驗方法測定AL原代新鮮細胞活細胞率為92％-99％之間，平均活細胞率為(96.16±2.37)％,而凍存復蘇后細胞活細胞率為64％-85.69％之間，平均活細胞率為(72.85±5.62)％，表明細胞凍存復蘇后細胞活性下降，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3.急

5、性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病原代白血病細胞密度為2×106cells/ml時鋪板最理想。
　　4.酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼對Ph+AL初診白血病細胞的體外藥敏作用
　　3例初診Ph+急性白血病患者原代白血病細胞24，48以及72小時后，白血病細胞平均細胞活性分別降低23.37±5.25%、31±6.43%、51±8.64%，達沙替尼處理原代細胞72小時抑制率較明顯，并且在達到1nm抑制濃度后三者的細胞活性不再隨著藥物濃

6、度的增加而降低。
　　5.酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼對AML初診白血病細胞的體外藥敏作用
　　14例AML患者初診白血病細胞對達沙替尼敏感，其中7例患者FLT3-ITD突變，3例患者C-kit突變，3例患者CBFB-MYH11融合基因陽性，1例患者BCR-ABL融合基因陽性；40例 AML患者初診白血病細胞對達沙替尼不敏感，其中5例患者AML-ETO融合基因陽性，3例患者FLT3-ITD突變,3例患者FLT3-TKD突變,8例

7、患者CEBPA雙突變，4例患者NPM1突變，2例患者PML-RARα融合基因陽性，2例DNMT3A突變，1例患者MLL-AF6融合基因陽性，1例患者MLL-AF10融合基因陽性。
　　6.酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼對B-ALL初診白血病細胞的體外藥敏作用
　　21例B-ALL患者初診白血病細胞對達沙替尼敏感，其中有18例患者BCR-ABL融合基因陽性，其他3例患者未發(fā)現(xiàn)常見的染色體、融合基因及基因突變異常。20例B-ALL患者

8、原代細胞對達沙替尼不敏感，亦沒有發(fā)現(xiàn)BCR-ABL融合基因等其他常見遺傳學異常。
　　7.酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼對T-ALL初診白血病細胞的體外藥敏作用
　　2例患者的白血病細胞對達沙替尼敏感，其中1例患者基因突變檢測發(fā)現(xiàn)有PTEN突變，另外1例患者未發(fā)現(xiàn)常見的染色體、融合基因及基因突變異常。12例T-ALL患者原代細胞對達沙替尼不敏感，其中有1例患者檢測到SET-CAN融合基因轉錄本，1例患者檢測到MLL-AF6融合基因

9、轉錄本，4例NOTCH1突變，3例患者FBXW7突變，1例NRAS突變。
　　8.酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼對HAL初診白血病細胞的體外藥敏作用
　　2例HAL患者的初診白血病細胞對達沙替尼敏感，他們BCR-ABL融合基因陽性，3例HAL患者的初診白血病細胞對達沙替尼不敏感，其中有1例患者檢測到NOTCH1及NRAS突變。
　　結論：
　　1.達沙替尼能抑制BCR-ABL陽性與NUP214-ABL1陽性的急性白血病

10、細胞系的生長；
　　2.進行CCK8體外藥敏試驗選用的AL患者的原代細胞需為新鮮細胞，凍存復蘇后的細胞活力差，影響CCK8試驗結果。
　　3.達沙替尼能抑制BCR-ABL陽性、部分FLT3-ITD突變、CBFB-MYH11、C-kit突變急性白血病患者原代白血病細胞的生長。
　　4.在體外成功建立了酪氨酸激酶抑制劑藥敏篩選系統(tǒng)，并確定了該體外藥敏檢測技術的最佳條件，CCK8酪氨酸激酶抑制劑體外藥敏試驗與分子遺傳學特點符