Runx2與Osx在修復(fù)性牙本質(zhì)形成過程中表達(dá)的研究.pdf

1、目的:
　　齲損和外傷是能引起牙髓炎性損傷，并最終導(dǎo)致人類牙列缺損的重要病因。然而當(dāng)牙齒發(fā)生齲損、物理摩擦，外傷等輕微損傷時(shí)，髓腔內(nèi)的牙髓細(xì)胞會(huì)發(fā)生遷徙，增殖，并分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而礦化成熟，成為反應(yīng)性牙本質(zhì)，亦稱修復(fù)性牙本質(zhì)。研究牙髓的損傷后修復(fù)機(jī)制為保存患牙提供了可能。Runx相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-relatedtranscription factor2，Runx2）和Osx(Osterix)是骨發(fā)生及骨形成中重要轉(zhuǎn)錄

2、因子，近期研究發(fā)現(xiàn)兩者均參與調(diào)控牙齒的發(fā)生和形成。牙本質(zhì)涎磷蛋白(Dentinsialoph-osphoprotein，DSPP)是成牙本質(zhì)細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志性蛋白，研究已證實(shí)其轉(zhuǎn)錄受Runx2調(diào)控。成骨相關(guān)報(bào)道中提示，Osx是Runx2的下游基因，Runx2基因有缺陷時(shí)，檢測不到Osx的表達(dá)，Osx激動(dòng)子區(qū)域有Runx2特有的結(jié)合元素，Runx2通過與其相結(jié)合，直接調(diào)控Osx的表達(dá)和功能，但二者在修復(fù)性牙本質(zhì)形成過程中是否發(fā)揮功能仍不

3、明了，而在牙齒發(fā)育過程中，Osx可以調(diào)節(jié)DSPP的表達(dá)。因此，本課題建立大鼠牙髓損傷模型，觀察損傷后不同時(shí)期修復(fù)性牙本質(zhì)形成過程中Runx2和Osx基因表達(dá)模式的變化，初步探討Runx2和Osx與修復(fù)性牙本質(zhì)形成之間的關(guān)系。
　　方法:
　　1.建立大鼠牙髓損傷模型。60只體質(zhì)量約為200g的雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和損傷模型組(n=10)。快機(jī)球鉆在50只損傷模型組大鼠雙側(cè)下頜第一磨牙常規(guī)行開髓術(shù)，開髓后不做任何處理，以

4、髓腔暴露時(shí)間0h，3h，12h，3d及7d對(duì)損傷模型組進(jìn)行分組，正常對(duì)照組不做開髓處理。隨后每組隨機(jī)選取4只灌注處死（共24只），取其雙側(cè)下頜第一磨牙及周圍下頜骨標(biāo)本并制成切片，以蘇木精-伊紅(H&E)染色法確定牙髓損傷模型的建立。
　　2.觀察Runx2、Osx和DSPP的蛋白和mRNA在大鼠下頜第一磨牙修復(fù)性牙本質(zhì)形成時(shí)表達(dá)模式的變化。通過免疫熒光的方法對(duì)正常對(duì)照組及損傷0h，3h，12h，3d及7d組標(biāo)本制備的切片進(jìn)行染色，

5、共聚焦顯微鏡下觀察Runx2、Osx和DSPP蛋白在各模型組中表達(dá)模式的變化。脫頸處死正常對(duì)照組及損傷0h，3h，12h，3d及7d組大鼠（共36只）并提取雙側(cè)下頜第一磨牙，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real-time PCR)，對(duì)其總RNA進(jìn)行定量分析，比較Runx2、Osx和DSPP mRNA在各組模型中表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:
　　1.牙髓損傷后成牙本質(zhì)細(xì)胞遷徙變性，損傷下方出現(xiàn)急性炎癥特征，在損傷7d，在損傷下方牙

6、髓腔內(nèi)可見修復(fù)性牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成。
　　2.Real-time PCR法檢測發(fā)現(xiàn):Runx2 mRNA表達(dá)量在損傷后12h最高，且顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，損傷后3d，Runx2 mRNA表達(dá)量顯著低于損傷后12h組(P＜0.01)，直至損傷后7d，Runx2 mRNA表達(dá)量持續(xù)降低，明顯低于損傷后12h組及3d組(P＜0.01)，但較之正常對(duì)照組其表達(dá)量有顯著差異。Osx和DSPP mRNA的表達(dá)量在損傷后0h較之對(duì)照組無

7、明顯差異(P＞0.05)，從損傷后3h開始表達(dá)量呈逐漸上升趨勢，且明顯高于對(duì)照組，組間比較均有顯著差異(P＜0.01);
　　免疫熒光染色發(fā)現(xiàn):Runx2、Osx和DSPP蛋白主要表達(dá)于損傷下方，Runx2表達(dá)呈“拋物線”狀，損傷后3天表達(dá)最為強(qiáng)烈(P＜0.01)，隨后逐漸下降;Osx和DSPP表達(dá)均呈逐漸上調(diào)的趨勢，Osx蛋白表達(dá)在損傷后7天上調(diào)最為明顯(P＜0.01)，而DSPP蛋白則在損傷后3天表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。