TPMT SNP與硫嘌呤藥物不良反應相關性的系統(tǒng)評價及其檢測方法的構建.pdf

1、硫嘌呤類藥物，包括硫鳥嘌呤、6-巰基嘌呤及其前體藥物硫唑嘌呤，于上世紀50年代由Elion和Hitchings首先發(fā)現(xiàn)。硫鳥嘌呤和6-巰基嘌呤用于炎癥性腸病穩(wěn)定期的誘導和維持治療，同時也是治療兒童急性淋巴細胞白血病最為廣泛應用的藥物之一。硫唑嘌呤則主要用于自身免疫性疾病及器官移植后排斥反應的治療。硫嘌呤類藥物的臨床療效和藥物不良反應存在很大的個體差異，因此如何合理、個體化、安全地使用硫嘌呤類藥物進行治療就具有非常重要的臨床意義。

2、　　巰基嘌呤甲基轉移酶(Thiopurine Methyltransferase，TPMT)是硫嘌呤類藥物的在體內代謝的關鍵酶，其活性的高低可以直接影響該類藥物的活性代謝產物6-硫代鳥嘌呤核苷酸在細胞內的蓄積濃度，進而影響該類藥物的臨床療效和藥物不良反應。TPMT存在明顯的遺傳多態(tài)性和種族地域差異，亞洲作是七大洲中人口最多，面積最大的一個洲，對TPMT基因型在亞洲人群中的分布沒有一個綜合全面的匯編;此外，中國是多民族國家，各民族的遺傳背

3、景、環(huán)境、生活習慣和生活地域有些不同，也缺少全面、細化的TPMT基因型分布。截止目前為止，盡管有不少研究調查了TPMT基因突變和硫嘌呤類藥物導致的藥物不良反應之間的相關性，但是結論不一致，TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物導致的藥物不良反應之間是否具有相關性仍然存在爭議?，F(xiàn)行的TPMT基因型/單核苷多態(tài)性比較常用的檢測方法都存在一定的局限性，無法滿足TPMT基因型的復雜性和多樣性的要求。
　　鑒于此，本研究首先采用綜合查找文獻的方法對

4、TPMT基因型在亞洲人群和中國人群中的分布做總結匯編，為臨床硫嘌呤類藥物個體化使用提供重要的理論基礎和為課題下一步實施提供數(shù)據支撐;在此基礎上，采用通過增大樣本量來增加統(tǒng)計學功效進而可以解決各個分散研究結論不一致的系統(tǒng)評價與Meta分析的方法對TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物相關的藥物不良反應相關性存在的爭議問題進行解決，進一步明確檢測TPMT基因突變的重要意義。隨后，初步構建一種基于聚合連接探針的TPMT單核苷多態(tài)性的新型檢測方法，以期

5、能實現(xiàn)對多個TPMT SNP簡便、高通量、單管并行檢測的目的。
　　目的：
　　(1)獲取TPMT基因型在亞洲人群和中國人群中的具體分布，為課題的下一步實施提供數(shù)據支撐。
　　(2)通過系統(tǒng)綜述和Meta分析的方法進一步明確炎癥性腸病患者、自身免疫疾病患者TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物不良反應之間的相關性，了解服用硫嘌呤類藥物之前檢測TPMT基因型的必要性。
　　(3)初步構建基于聚合連接探針的TPMT單核苷酸多

6、態(tài)性檢測方法。
　　方法：
　　(1)通過系統(tǒng)檢索PubMed、Excerpta Medica Database和Chinese BiomedicalDatabase等數(shù)據庫中有關TPMT基因型在亞洲人群和中國人群中分布的研究文獻，對TPMT基因型和等位基因在亞洲人群和中國人群中的分布做一整理歸納。檢索詞分別為“硫嘌呤甲基轉移酶”，“TPMT”，“Thiopurine S-methyltranferase”，“Polympo

7、rphism”，“Hepalotype”等。
　　(2)檢索了PubMed，Web of Science和Excerpta Medica Database三大數(shù)據庫關于炎癥性腸病患者和自身免疫疾病患者TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物不良反應之間相關性的文獻。納入的文獻比較了服用硫嘌呤類藥物后發(fā)生藥物不良反應和沒有發(fā)生藥物不良反應TPMT突變基因型的分布。提取相關數(shù)據并采用Revman5.3軟件計算對應的95％置信區(qū)間。
　　(

8、3)設計并合成針對TPMT單核苷多態(tài)性的聚合連接探針;對通用引物、聚合酶、連接酶、dNTP濃度等反應體系進行優(yōu)化，確定基于聚合連接探針的TPMT單核苷酸多態(tài)性的最佳反應條件和反應體系。
　　結果：
　　(1)根據制定的納入標準，共有來自16個國家/地區(qū)的68篇文章是關于TPMT基因型在亞洲人群中的分布，納入人數(shù)共18，234人。亞洲人群中TPMT突變基因型百分比為3.54％，TPMT*1/*3C和TPMT*1/*3A是主要的

9、突變基因型，分別占總體突變基因型的69.72％和16.15％;突變基因型純合子在亞洲人群中并不多見，在所納入的18，234人中，只發(fā)現(xiàn)了11例突變基因型純合子和1例突變基因型復合雜合子;TPMT突變等位基因總體百分比為1.80％，TPMT*3C占總體突變等位基因的70.93％(66/657)，其次是TPMT*3A;進一步明確了TPMT*3C只是東亞和東南亞最常見的突變型等位基因。
　　(2)共有30篇中文文獻和14篇英文文獻關于T

10、PMT基因型在中國人群中的分布，納入10，458人。中國人群中TPMT基因型總體突變率為2.91％，主要的突變基因型為TPMT*1/*3C，TPMT*1/*3A;主要的突變等位基因為TPMT*3C，占總體突變等位基因的97.05％，TPMT*3A主要在哈薩克斯坦族和維吾爾族人群中發(fā)現(xiàn)的，在漢族人群中未發(fā)現(xiàn)TPMT*3A;目前針對少數(shù)民族TPMT基因型分布的研究較少，需要更多的研究來加以證實。
　　(3)炎癥性腸病患者TPMT基因突

11、變與硫嘌呤類藥物不良反應的系統(tǒng)評價與Meta分析納入了14篇文獻，涉及的病例數(shù)達到2，206例。結果表明TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物導致的總體藥物不良反應和骨髓毒性是明顯相關的，合并比值比（95％置信區(qū)間）分別是3.36(1.82-6.19)和6.67(3.88-11.47)。TPMT基因突變與其他的藥物不良反應的發(fā)生沒有明顯相關性，如肝臟毒性作用、胰腺炎、腸胃不耐受、流感樣癥狀和皮膚反應，合并比值比（95％置信區(qū)間）分別是1.27(

12、0.60-2.71)，0.97(0.38-2.48)，1.82(0.93-3.53),1.28(0.47-3.46)和2.32(0.86-6.25)。
　　(4)自身免疫疾病患者TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物不良反應的系統(tǒng)評價與Meta分析納入了11篇文獻，涉及的病例數(shù)達到了651例。結果表明TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物導致的總體藥物不良反應、骨髓毒性和腸胃不耐受呈顯著相關，合并比值比（95％置信區(qū)間）分別是3.12(1.48-

13、6.56)，3.76(1.97-7.17)和6.43(2.04-20.25)。TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物導致的肝臟毒性作用沒有顯著相關性，合并比值比(95％置信區(qū)間)是2.86(0.32-25.86)。
　　(5)完成了針對TPMT*2，TPMT*3A～*3C的聚合連接探針的設計和合成，確定了TPMT單核苷酸多態(tài)性的檢測條件和反應體系:通用引物為來自為噬菌體M13啟動子序列;聚合酶為沒有外切酶活性的Exo(-) pfu DNA

14、聚合酶;連接酶為Ligase-65;dNTP的濃度為2 mM; ABI3500片段分析的條件為POP4膠和36厘米毛細管。
　　結論：
　　(1)TPMT基因型在亞洲人群的分布不盡相同，進一步明確了基于TPMT基因型進行硫嘌呤類藥物治療的重要性。很多亞洲國家在藥物基因組學方面的研究不多，了解這些國家TPMT基因型的分布將有助于患者進行安全的硫嘌呤類藥物治療。
　　(2)我國是一個多民族的國家，各民族的遺傳背景、生活地域

15、、環(huán)境和生活習慣有些不同，目前針對少數(shù)民族TPMT基因多態(tài)性研究的較少，需要更多的研究來加以證實;根據我國不同地區(qū)和民族選擇性進行TPMT基因型檢測，不但可有效的指導硫嘌呤類藥物的個體化用藥，而且可節(jié)約醫(yī)療成本，減輕患者經濟負擔。
　　(3)在炎癥性腸病患者中，TPMT基因突變與發(fā)生總體藥物不良反應、骨髓毒性具有強相關性，而與肝臟毒性作用、腸胃不耐受、流感樣癥狀和皮膚反應不具有相關性。在自身免疫疾病患者中，TPMT基因突變與發(fā)生總

16、體藥物不良反應、骨髓毒性和腸胃不耐受具有顯著相關性，與肝臟毒性作用不具有相關性，該結果對開展硫嘌呤類藥物個體性用藥有一定的參考和指導意義。目前有不少臨床指南推薦和建議患者在服用該類藥物之前進行TPMT基因型的檢測，我們的研究結果也間接論證了在服用硫嘌呤類藥物之前檢測TPMT基因型的必要性和提供了循證醫(yī)學的依據。但有一點應該強調，服藥前進行TPMT基因型的檢測不能替代目前的全血細胞計數(shù)監(jiān)測方法，兩者應該合并使用才能最大化硫嘌呤類藥物療效和