基于多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增及多重鏈置換擴增技術(shù)對脊髓性肌萎縮疾病PGD的前期研究.pdf

1、脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy, SMA)是一類由脊髓前角運動細胞退行性變而引起的進行性、對稱性肢體近端肌無力和萎縮的致死性常染色體隱性遺傳病。約有1/6000-1/10000的發(fā)病率，其在致死常染色體隱性遺傳病中的發(fā)病率僅次于囊性纖維化,在中國南方人群SMA攜帶率為1/35～1/80。SMA的致病基因SMN1存在與其高度同源的SMN2拷貝，二者只有5個堿基差異,但是目前大多數(shù)研究認為這兩個高度同源的基因在

2、7號外顯子上的C-T堿基差異是導致二者功能不同的主要原因。至今SMA仍是缺乏有效治療的一種致死性疾病，以往以產(chǎn)前診斷和選擇性流產(chǎn)來預(yù)防SMA患兒出生。然而，胎兒一旦經(jīng)產(chǎn)前診斷的方法診斷為SMA，孕婦將要面臨終止妊娠，這對孕婦及其家庭而言是一個不堪言的巨大打擊。
　　胚胎植入前診斷（preimplantation genetic diagnosis, PGD)是發(fā)展起來的第三代試管嬰兒技術(shù)，它能比產(chǎn)前診斷更早的對疾病進行診斷。其主要

3、借助輔助生殖技術(shù)（ ART）獲取體外培養(yǎng)的胚胎,并從中獲取單個或數(shù)個細胞進行遺傳學的檢測與診斷，依據(jù)檢測結(jié)果選擇無遺傳缺陷的胚胎移植回母體子宮，從而獲得無遺傳缺陷的妊娠,避免了產(chǎn)前診斷終止妊娠的痛苦。而PGD的取材有限,在很大程度上限制了PGD的順利進行,成為了PGD的瓶頸問題之一。
　　為了解決這個關(guān)鍵問題，全基因組擴增(whole genome amplification，WGA)技術(shù)應(yīng)運而生。目前有多種WGA方法， MDA因

4、其技術(shù)成熟，擴增產(chǎn)物濃度高而在PGD領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。而MALBAC作為一種新型的WGA技術(shù)，因其可在單細胞水平高效地檢測單核苷酸變異(SNV)及拷貝數(shù)變異(CNV)，正受到越來越多的關(guān)注。針對SMA致病基因的高度同源性，僅有一個堿基的差異起著決定性作用，因此選擇一個適宜的全基因組擴增方法對于SMA的PGD成功是非常關(guān)鍵的。
　　目的:
　　本研究通過使用傳統(tǒng)的Sanger測序、微衛(wèi)星分析診斷技術(shù)，分別比較MDA、MALBA

5、C單細胞擴增法在PGD中不同的細胞數(shù)（單細胞、2個細胞、5個細胞）的擴增成功率、ADO率及對SMA診斷準確率。從而，優(yōu)化活檢細胞數(shù)，評估兩種擴增方法的優(yōu)劣，建立一種更適合SMA疾病的PGD的體系。
　　材料:
　　取本研究所建立的2株成纖維細胞系和本院生殖中心廢棄的胚胎單個卵裂球細胞做為研究材料。其中包括:1株SMN1基因純合缺失的SMA疾病成纖維細胞（S）；1株正常人包皮成纖維細胞(N);SMN1基因正常的廢棄胚胎單個卵裂

6、球，一共取得277份標本。其中，單個細胞157份：MALBAC擴增組（簡稱L組）78份，MDA擴增組（簡稱D組）79份；2細胞60份：L組30份， D組30份；5細胞60份：L組30份， D組30份；
　　方法:
　　1．單細胞、2細胞、5細胞的制備。
　　2．對 L組/D組中不同種類、不同數(shù)目的細胞，進行MALBAC/MDA擴增。
　　3．應(yīng)用Sanger測序法分別對MALBAC、MDA的產(chǎn)物進行SMN1，SM

7、N2基因檢測。
　　4．應(yīng)用單重熒光PCR法分別對MALBAC、MDA的產(chǎn)物，擴增與SMN1基因緊密連鎖的三個 STR位點 D5S1967、GATA141B10和 D5S1491,以進行ADO和污染的檢測。
　　結(jié)果:
　　1．兩種擴增方法在總位點的擴增成功率（ L組95.83％低于 D組98.03%），總的ADO率（L組2.52%低于D組3.75%），總的診斷準確率（L組94.7%低于D組97.8%）上的比較,差異均

8、無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。
　　2．兩種擴增方法在不同起始擴增細胞數(shù)目的組內(nèi)結(jié)果比較。MALBAC擴增方法在單細胞水平與同組中的5細胞相比的，單細胞水平的擴增成功率更
　　低、ADO率更高,診斷準確率更低，二者對應(yīng)的率比較，差異有統(tǒng)計學意義（ p<0.05）。MDA擴增方法在單細胞水平與同組中的2細胞或者5細胞相比，單細胞水平的擴增成功率更低、ADO率更高,診斷準確率更低，二者對應(yīng)的率比較，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05

9、）。其余組內(nèi)率的兩兩比較差均無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。
　　3．兩種擴增方法在相同起始擴增細胞數(shù)目的組間結(jié)果比較。單細胞水平上：位點擴增成功率和ADO率上兩種擴增方法無統(tǒng)計學差異（p>0.05），但在結(jié)合sanger測序方法對SMA疾病診斷中， MDA擴增法的診斷準確率96.05%（73/76）高于 MALBAC擴增法91.7%（67/73），二者差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.107, p<0.05)；2細胞/5細胞水平上：兩種擴

10、增方法都有類同的診斷準確率、擴增效率、ADO率，以上各率在兩種擴增方法之間的比較，差異無統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1．首次將MALBAC/MDA結(jié)合傳統(tǒng)的Sanger測序、STR分析檢測方法，對 SMA疾病進行 PGD，建立了SMA疾病的高效，穩(wěn)定 MALBAC/MDA的PGD體系，為日后SMA的PGD打下基礎(chǔ)。
　　2．在單細胞水平上，應(yīng)運傳統(tǒng)檢測方法（一代測序法和微衛(wèi)星分析）進行SMN1致病基因