多重置換擴(kuò)增聯(lián)合單倍體分析對(duì)DMD行植入前診斷的可行性研究.pdf

1、植入前遺傳學(xué)診斷(Preimplantation Genetic Diagnosis，PGD)是與輔助生殖技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行的一種遺傳學(xué)診斷技術(shù)。PGD在遺傳診斷后將無(wú)遺傳缺陷的胚胎植入母體子宮，診斷在妊娠發(fā)生之前，因此防止了遺傳病的發(fā)生。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是神經(jīng)肌肉系統(tǒng)中最常見(jiàn)的X-連鎖隱性遺傳病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，目前尚無(wú)有效治療方法，主要通過(guò)產(chǎn)前診斷防止DMD患兒的

2、出生。對(duì)DMD進(jìn)行PGD不僅可以防止DMD患兒的出生，而且能夠避免反復(fù)流產(chǎn)、引產(chǎn)對(duì)孕婦造成的身心傷害，是一種優(yōu)于產(chǎn)前診斷的孕前診斷。由于PGD的分析材料極其有限，通常只有1-2個(gè)細(xì)胞，限制了DMD-PGD的開(kāi)展，而常用的FISH性別鑒定又導(dǎo)致正常男性胚胎的銷毀，因此開(kāi)展DMD-PGD，需建立有效的單細(xì)胞擴(kuò)增方法和更安全的診斷技術(shù)。
　　 目的：本文旨在通過(guò)多重置換擴(kuò)增(Multiple displacementamplifica

3、tion，MDA)及單倍體分析(haplotyping)的聯(lián)合運(yùn)用，探討MDA和單倍體分析在DMD-PGD中應(yīng)用的可行性，擬建立一種更為高效、安全的DMD-PGD方法。
　　 方法：選擇高雜合度的8個(gè)STR位點(diǎn)及3個(gè)性別鑒定位點(diǎn)，對(duì)12對(duì)無(wú)DMD家族史的ICSI/IVF-ET夫婦的胚胎行MDA后的植入前單體型分析(Preimplantation genetic haplotyping，PGH)(其中3對(duì)僅用4個(gè)STR及1個(gè)性別鑒

4、定位點(diǎn))。首先采用MDA對(duì)單卵裂球細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，然后對(duì)胚胎及其親本進(jìn)行單倍體分析。在隨機(jī)假設(shè)母本某一單體型為致病單體型的前提下，對(duì)胚胎進(jìn)行遺傳分析。
　　 結(jié)果：共收集胚胎19枚，其中雙原核胚胎11枚，單原核胚胎1枚，三原核胚胎2枚，不明受精胚胎5枚。共取卵裂球51枚，1枚MDA發(fā)生污染，6枚MDA失敗，單卵裂球MDA成功率86.3％(44/51)。44枚MDA成功的卵裂球單體型均獲成功分析，單倍體分析成功率100％(4

5、4/44)，MDA-PGH成功率86.3％(44/51)。33枚雙原核胚胎卵裂球中，28枚MDA成功，MDA-PGH成功率84.9％(28/33)，平均ADO(allele drooout)和AF(amolification failure)分別為25.3％和3.2％。在假設(shè)母親某一單體型攜帶DMD3-11號(hào)和44-45號(hào)外顯子缺失突變的前提下，25枚卵裂球單倍體分析結(jié)果示胚胎為正常男性或DMD女性攜帶者，另外3枚卵裂球?yàn)閱伪扼w，示胚胎

6、異常。取自異常受精胚胎的18枚卵裂球中，16枚MDA成功，MDA-PGH成功率88.9％(16/18)。
　　 結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)MDA成功率86.3％，比文獻(xiàn)報(bào)道稍低，單倍體分析成功率達(dá)100％，可聯(lián)合用于臨床PGD。2.對(duì)DMD行植入前單倍體分析，各單體型針對(duì)突變選擇的STRs中，≥2個(gè)為有效位點(diǎn)時(shí)，選擇4個(gè)和選擇8個(gè)STRs的單倍體分析成功率均可達(dá)100％。3.單倍體分析聯(lián)合性別鑒定，不僅可鑒定DMD女性攜帶者，還可鑒定正常