雄激素及其受體調(diào)控Srsf4表達的分子機理.pdf

1、大量的臨床與實驗研究資料表明，雄激素及其受體（Androgen receptor, AR）在精子發(fā)生過程中具有非常重要的作用。雄激素水平低下或AR基因突變可導(dǎo)致精子發(fā)生障礙和男性不育癥；睪丸組織內(nèi)不同細胞類型的條件性 Ar基因敲除小鼠研究表明，雄激素主要通過與睪丸支持細胞的AR作用，調(diào)控精子發(fā)生過程。因此，近年來人們一直在睪丸支持細胞尋找受雄激素及其受體調(diào)節(jié)的靶基因。本實驗室采用數(shù)字化表達譜測序技術(shù)（Digital gene expre

2、ssion sequencing, DGE-seq）篩選到受雄激素及其受體下調(diào)的候選靶基因之一Srsf4（serine/arginine-rich splicing actor4）。最新的研究發(fā)現(xiàn)SRSF4與非梗阻性無精子癥存在相關(guān)性，因此，我們推測Srsf4可能是支持細胞中受雄激素及其受體調(diào)控的靶基因。
　　目的:通過全身 Ar基因敲除小鼠模型和小鼠睪丸支持細胞來源的細胞系研究SRSF4受雄激素及其受體調(diào)控的分子機理及其與精子發(fā)

3、生的關(guān)系，為進一步探索治療男性不育癥的方法提供新的思路。
　　方法:我們采用qRT-PCR和免疫熒光技術(shù)檢測小鼠睪丸組織中Srsf4的表達量及SRSF4的表達定位。我們采用qRT-PCR、western blot和免疫熒光染色等技術(shù)比較全身AR基因敲除和野生型小鼠睪丸中SRSF4的表達差異、睪丸支持細胞系TM4細胞過表達及敲減AR后SRSF4的表達差異。同時，我們構(gòu)建雄激素下調(diào)的動物模型，采用qRT-PCR檢測Srsf4的mRNA

4、水平。最后，我們采用雙熒光素酶報告載體實驗、凝膠遷移實驗和染色質(zhì)免疫共沉淀等方法研究雄激素及其受體調(diào)控 SRSF4的分子機理。
　　結(jié)果:SRSF4在睪丸組織中高表達，主要定位于睪丸支持細胞。與野生型雄鼠相比，全身Ar基因敲除小鼠睪丸組織中SRSF4表達顯著升高。在TM4細胞中過表達AR后SRSF4表達下降，而敲減AR后SRSF4表達上升，并且，我們在出生后7天雄鼠身上注射氟他胺干擾內(nèi)源性睪酮水平發(fā)現(xiàn) Srsf4表達上升，繼續(xù)注射

5、睪酮后Srsf4表達回降，這些結(jié)果均提示SRSF4受雄激素及其受體下調(diào)。雙熒光素酶報告載體實驗，凝膠遷移實驗和染色質(zhì)免疫共沉淀等研究結(jié)果表明，雄激素及其受體特異性與Srsf4基因啟動子區(qū)域的雄激素反應(yīng)原件(androgen-responsive element, ARE)位點結(jié)合，下調(diào)其表達。
　　結(jié)論:在小鼠睪丸支持細胞中，雄激素及其受體直接特異性結(jié)合與 Srsf4基因啟動子區(qū)域的ARE位點結(jié)合，從而下調(diào)其表達，表明Srsf4是