狹鱈魚皮膠原蛋白肽防治地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松作用研究.pdf

1、目的：復(fù)制地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松模型和成骨細(xì)胞損傷模型，研究狹鱈魚皮膠原肽對(duì)骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用。建立高效液相色譜法同時(shí)檢測Pro-Hyp和 Gly-Pro-Hyp的方法，確認(rèn)小分子肽的生物活性。
　　方法:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將100只8周齡wistar雄性大鼠隨機(jī)分為5組，預(yù)防給藥組（造模4周前給藥膠原蛋白肽1g/kg/d，連續(xù)給藥23周）治療組（造模6周后給藥膠原蛋白肽0.5g、1g/kg/d，連續(xù)用藥13周）地塞米松損傷組，正常

2、對(duì)照組；除正常對(duì)照組外，其余各組在大鼠12周齡時(shí)，每周2次臀肌注射地塞米松磷酸鈉注射液1.0 mg/kg，對(duì)大鼠股骨X光經(jīng)時(shí)攝片（10、16、23周），經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，ELISA法同期檢測BALP、PINP、CTX-1、TRAP含量，HE染色經(jīng)時(shí)測量骨小梁面積的百分比和骨皮質(zhì)厚度，免疫組織化學(xué)法檢測TGF-β的表達(dá)。高效液相色譜方法為：色譜柱venusic ASB-C18(250mm×4.6mm，5um)，柱溫：40℃；流動(dòng)相：乙腈和純

3、水梯度洗脫；流速：1.0ml/min；檢測波長：220nm。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：建立并鑒定大鼠顱骨源成骨細(xì)胞，復(fù)制地塞米松損傷模型，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：正常組、地塞米松損傷組、膠原蛋白肽（100、200和400 ug/ml）組、三肽（200 ug/ml）組、RU486地塞米松拮抗劑組，采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞的存活率；Western blotting法檢測骨鈣蛋白（OCN）的表達(dá)。
　　結(jié)果：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：成功復(fù)制了地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松模型，經(jīng)X光

4、片灰度值分析，模型組（64.49±2.71）較正常組（109.23±1.48）顯著降低（P<0.01）,并持續(xù)穩(wěn)定至實(shí)驗(yàn)期末，膠原蛋白肽預(yù)防組（連續(xù)給藥10周）灰度值較同期模型組升高，且隨給藥時(shí)間延長遞增，兩個(gè)劑量治療組（連續(xù)給藥6周）灰度值均升高，給藥13周時(shí)分別升至76和84左右（P<0.01），大劑量治療效果好于小劑量組。骨關(guān)節(jié)HE染色結(jié)果表明，模型組骨小梁數(shù)量減少，其面積百分比較正常組下降50％，且連接間隙較大，空腔面積亦擴(kuò)大，

5、還可見部分骨皮質(zhì)斷裂，骨皮質(zhì)厚度呈現(xiàn)不同程度的變薄。預(yù)防組連續(xù)給藥16周時(shí)，骨組織學(xué)觀察指標(biāo)改善，骨小梁面積百分比由47%升至56%，較模型組35%差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且隨增時(shí)骨病理組織學(xué)指標(biāo)進(jìn)一步好轉(zhuǎn)。大小劑量治療組對(duì)骨形態(tài)指標(biāo)的影響均較同期模型組升高，也呈時(shí)間依賴性，以大劑量組治療效果為佳。免疫組織化學(xué)經(jīng)時(shí)檢測TGF-β平均積分光密度發(fā)現(xiàn)，模型組較正常組降低，差異具有顯著性，膠原蛋白肽預(yù)防給藥10周大鼠TGF-β1平

6、均積分光密度值升高，并呈經(jīng)時(shí)性升高，成模后經(jīng)大小劑量治療6周該光密度積分值開始升高，也呈經(jīng)時(shí)性增加（P<0.05）。ELISA結(jié)果顯示，模型組血清骨形成指標(biāo)BALP、PINP的含量較正常組顯著降低（p<0.01），膠原蛋白肽各給藥組均較模型組呈時(shí)間依賴性升高（p<0.05），模型組血清骨吸收 CTX-1、TRAP較正常組的含量升高，膠原蛋白肽防治各組均較模型組經(jīng)時(shí)性降低（p<0.05）。高效液相色譜法：檢測 Pro-Hyp的濃度在0.0

7、05 mg/ml～0.5 mg/ml（R2=0.9999）、Gly-Pro-Hyp的濃度在0.01 mg/ml～1 mg/ml（R2=0.9998），線性關(guān)系良好；Pro-Hyp（低、中、高濃度）的平均回收率分別為99.26%、98.77和99.07，RSD分別為1.71,2.63和2.33；Gly-Pro-Hyp（低、中、高濃度）的平均回收率分別為98.89%,98.22%和99.57%，RSD分別為1.70，1.20和0.84。表明

8、Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp的加樣回收率良好。正常組Pro-Hyp、Gly-Pro-Hyp含量分別為0.096、0.079（mg/ml），模型組血清小分子肽含量明顯降低，分別為0.029、0.044（mg/ml），預(yù)防給藥組小分子肽含量較模型組顯著升高，為0.148、0.107（p<0.01）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：經(jīng)10-5mol/L地塞米松損傷48h后成功復(fù)制成骨細(xì)胞損傷模型，狹鱈魚皮膠原蛋白肽三個(gè)劑量能提高成骨細(xì)胞存活率為70%，但

9、組間無顯著差異（P>0.05），三肽組作用高達(dá)139%(P<0.01）。Western Blot檢測到膠原蛋白肽和三肽組骨鈣蛋白表達(dá)量也較模型組顯著升高，以三肽組作用最為顯著。
　　結(jié)論：狹鱈魚皮膠原蛋白肽在實(shí)驗(yàn)劑量下能呈時(shí)間依賴性防治大鼠地塞米松性骨質(zhì)疏松；大鼠血清 Gly-Pro-Hyp和Pro-Hyp的含量與骨質(zhì)疏松呈負(fù)相關(guān)，膠原蛋白肽抗骨質(zhì)疏松作用可能與在小分子活性小肽有關(guān)；狹鱈魚皮膠原蛋白肽和三肽均能直接促進(jìn)顱骨源成骨細(xì)