H19調(diào)控miR-29a影響膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的機制研究.pdf

1、目的：
　　膠質(zhì)瘤是具有強血管侵襲性的中樞系統(tǒng)惡性腫瘤，其復(fù)發(fā)率和死亡率非常高。膠質(zhì)瘤中血管生成的速度很快，使手術(shù)、放療和化療等常規(guī)治療方法對其治療效果不佳?，F(xiàn)在，研究者開始關(guān)注膠質(zhì)瘤的血管生成在其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用。因此，抑制膠質(zhì)瘤血管生成有望成為一種治療膠質(zhì)瘤的新策略。
　　與正常血管相比，腫瘤的血管有著不一樣的結(jié)構(gòu)和功能特點，但腫瘤的血管生成也是由促血管生長因子和抑制因子共同協(xié)調(diào)作用的一系列復(fù)雜過程。膠質(zhì)瘤細(xì)胞通

2、過外分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等促血管生成的細(xì)胞因子，作用于腫瘤微環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成。
　　LncRNA是指轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，自身不編碼蛋白，以RNA形式在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多層面上調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)水平，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用。人們發(fā)現(xiàn)的第一個lncRNA就是H19?，F(xiàn)有的證據(jù)顯示，H19對膀胱癌血管的調(diào)

3、節(jié)起促進(jìn)作用，然而H19對膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為是否有調(diào)節(jié)作用目前尚不清楚。
　　MiRNAs是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，它多在基因的轉(zhuǎn)錄后水平上通過與靶基因mRNA的完全或不完全互補結(jié)合，將靶基因的mRNA降解或抑制其翻譯。有證據(jù)表明，miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管形成等多種方面均有調(diào)節(jié)作用。
　　VASH是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種血管生成抑制蛋白，有2個同系物，即VASH1和VASH2。VASH

4、1是在血管新生中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用的內(nèi)皮源性蛋白，而VASH2則是一種非內(nèi)皮細(xì)胞固有的并且不依賴于血管內(nèi)皮生長因子的促血管生成因子。兩者均在血管生成的調(diào)節(jié)過程中起重要作用。
　　本研究旨在探究H19、miR-29a和VASH2在膠質(zhì)瘤血管生成中的調(diào)節(jié)效應(yīng)，并且揭示其可能的機制。
　　方法：
　　1.人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)、膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞(GECs)、膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和HEK293的培養(yǎng)。
　　2.分別構(gòu)建H

5、19過表達(dá)和表達(dá)沉默質(zhì)粒。
　　3.Real-time PCR方法檢測H19和miR-29a的表達(dá)變化。
　　4.CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力的變化。
　　5.Transwell檢測細(xì)胞遷移能力的變化。
　　6.體外血管形成實驗檢測細(xì)胞體外血管形成能力的變化。
　　7.Western Blot方法檢測VASH2蛋白的表達(dá)變化。
　　8.雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析H19與miR-29a，VASH2與miR

6、-29a的結(jié)合能力。
　　結(jié)果：
　　1.H19在膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈高水平;上調(diào)H19能夠增強膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移和管形成的能力，下調(diào)H19能夠降低膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移和管形成的能力。
　　2.過表達(dá)H19后miR-29a水平下降;沉默H19后miR-29a水平上升;H19存在與miR-29a的結(jié)合位點。
　　3.MiR-29a在膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈低水平;下調(diào)miR-29a能夠增強膠質(zhì)瘤血

7、管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移和管形成的能力，上調(diào)miR-29a能夠降低膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移和管形成的能力。
　　4.同時過表達(dá)H19和沉默miR-29a時，顯著增強膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移和管形成的能力;同時沉默H19和過表達(dá)miR-29a時，顯著降低膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移和管形成的能力。
　　5.上調(diào)H19能夠促進(jìn)VASH2的表達(dá)，下調(diào)H19能夠抑制VASH2的表達(dá)。
　　6.過表達(dá)miR-29a下調(diào)VAS

8、H2的表達(dá);沉默miR-29a上調(diào)VASH2的表達(dá);VASH2與miR-29a靶向結(jié)合，存在結(jié)合位點。
　　7.同時過表達(dá)H19和沉默miR-29a時，顯著增加VASH2的表達(dá);同時沉默H19和過表達(dá)miR-29a時，顯著減少VASH2的表達(dá)。
　　8.雙過表達(dá)miR-29a和VASH2-ORF，與單獨過表達(dá)miR-29a的作用相反，顯著增強了細(xì)胞增殖、遷移和管形成能力;然而，雙過表達(dá)miR-29a和VASH2-ORF-3'

9、UTR時，與雙過表達(dá)miR-29a和VASH2-ORF相比，顯著減弱了細(xì)胞增殖、遷移和管形成能力。
　　結(jié)論：
　　1.在膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中，H19的表達(dá)上調(diào)，miR-29a的表達(dá)下調(diào)。
　　2.H19與miR-29a存在結(jié)合作用。VASH2是miR-29a的靶基因，miR-29a負(fù)性調(diào)控膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的VASH2的表達(dá)。
　　3.H19-miR-29a-VASH2軸在影響膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為過程中