運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞中hSOD1-G93A基因?qū)BK1的影響.pdf

1、目的：肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）是一種致命的、進(jìn)行性的運(yùn)動神經(jīng)元變性病，以運(yùn)動神經(jīng)元的功能缺失為主要特征。超氧化物岐化酶1（SOD1）突變假說在ALS發(fā)病機(jī)制中占有重要地位，尤以突變基因研究最為廣泛。本實(shí)驗(yàn)以hSOD1-G93A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染運(yùn)動神經(jīng)元雜交瘤細(xì)胞（NSC34），探索突變SOD1對TANK結(jié)合蛋白激酶1（TANK-Binding Kinas,1，TBK1）的影響，為以后的研究打下基礎(chǔ)。TBK1是一種廣泛表達(dá)的蛋白激酶，在細(xì)胞的多種

2、生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用。TBK1是一種非典型的IΚB激酶（IKK）相關(guān)的蛋白激酶。TBK1由729個氨基酸組成，包含4個功能結(jié)構(gòu)域：N末端結(jié)構(gòu)域，泛素樣結(jié)構(gòu)域和兩個 C末端結(jié)構(gòu)域（亮氨酸拉鏈和螺旋-環(huán)-螺旋模體）。TBK1在自噬中起著重要作用，此外也參與固有免疫，清除細(xì)菌，抑制細(xì)胞生長和增殖。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)分組
　　本研究中使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 hSOD1-G3A(突變組)的 NSC-34細(xì)胞系作為ALS細(xì)胞模

3、型，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（Empty）、hSOD1-野生型（WT）的NSC-34細(xì)胞系作為對照組。
　　2.藥物干預(yù)
　　空質(zhì)粒組、野生型組和突變組三種細(xì)胞系以相似的密度接種于孔板中，分別加入自噬阻斷劑巴菲羅霉素A（Bafilomycin A）和蛋白酶體阻斷劑MG132。然后分別通過細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cck-8）檢測細(xì)胞活力；激光共聚焦顯微鏡觀察SOD1突變對pTBK1表達(dá)數(shù)量的影響；Western Blot檢測SOD1、TBK1、

4、pTBK1以及自噬相關(guān)蛋白P62、LC3B-II的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.巴菲羅霉素A和MG132均降低三種細(xì)胞的細(xì)胞活力，但突變組較空質(zhì)粒組和野生型組下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；2.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察突變組給予自噬阻斷劑后較空質(zhì)粒組pTBK1表達(dá)數(shù)量降低。3.Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)Bafilomycin A增加自噬相關(guān)蛋白P62、LC3B-II的表達(dá)水平，此外干預(yù)后突變組pTBK1的表達(dá)水平較空質(zhì)粒

5、組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；空質(zhì)粒組總的TBK1給予Bafilomycin A后增多（P<0.05），但突變組未見明顯變化。MG132干預(yù)后 P62、LC3B-II增多，但突變組pTBK1水平較空質(zhì)粒組降低，總的TBK1水平?jīng)]有變化。
　　結(jié)論：
　　1.突變的SOD1通過自噬和蛋白酶體通路降解。
　　2.巴菲羅霉素A干預(yù)后，突變組pTBK1較空質(zhì)粒組降低，說明SOD1突變阻礙TBK1的活化?？召|(zhì)粒組總的TBK1在給予自