番茄紅素對轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A的NSC34細(xì)胞的保護作用及機制研究.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化癥為神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的一種，其特征是選擇性的侵犯脊髓前角細(xì)胞、腦干運動神經(jīng)元、皮質(zhì)錐體細(xì)胞及錐體束，導(dǎo)致上、下運動神經(jīng)元變性死亡?；颊叱霈F(xiàn)上下運動神經(jīng)元同時損害的臨床特征，以單側(cè)或雙側(cè)手指活動笨拙無力為常見首發(fā)癥狀。本病晚期出現(xiàn)延髓麻痹，在患者意識始終清醒的情況下，出現(xiàn)舌肌萎縮、構(gòu)音不清、飲水嗆咳、吞咽困難等癥狀，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，給患者帶來巨大痛苦。隨著疾病病程的持續(xù)進展，在發(fā)病之后3～7年內(nèi)多因呼吸肌受累死于

2、肺部感染或呼吸肌麻痹所致的呼吸衰竭。目前國際范圍內(nèi)對ALS發(fā)病機制的相關(guān)研究主要關(guān)注于其相關(guān)突變蛋白hSOD1-G93A，因此，針對此突變蛋白所造成的損傷進行治療方面的研究就具有重要意義。番茄紅素是一種含有碳碳共軛雙鍵的類胡蘿卜素，因其結(jié)構(gòu)中大量的C=C-C=C存在使得其具有抗氧化能力?，F(xiàn)有研究證實，番茄紅素能夠通過Nrf2-ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，從而保護細(xì)胞，對抗氧化損傷。目前研究發(fā)現(xiàn)，在SOD1突變模型中，至少有

3、14種受Nrf2調(diào)控的基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，包括NQO1、GST、HO-1、細(xì)胞色素P450、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等。但是目前國內(nèi)外均缺乏將番茄紅素應(yīng)用于治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的體外實驗證據(jù)。本實驗采用突變的hSOD1-G93A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSC34細(xì)胞，從抗氧化應(yīng)激角度探討番茄紅素對轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A的NSC34細(xì)胞的影響及其可能機制，為將來尋求治療肌萎縮側(cè)索硬化癥廣泛普及的藥物打下初步的研究基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、實驗

4、分組
　　實驗設(shè)置空白對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A組以及不同濃度的番茄紅素處理組(1.5μmol/L，2.5μmol/L，7.5μmol/L)。以DMSO溶解番茄紅素，于轉(zhuǎn)染操作后24小時向各組細(xì)胞加入DMSO或不同劑量的番茄紅素(1.5μmol/L，2.5μmol/L，7.5μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24小時，用于后續(xù)實驗。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
　　取凍存于液氮罐中的NSC34細(xì)胞，予以復(fù)蘇。培

5、養(yǎng)液使用含有10％滅活的胎牛血清及青鏈霉素的高糖DMEM，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2。于細(xì)胞復(fù)蘇傳代3次以后，待細(xì)胞突起明顯、形態(tài)良好、匯合度為80％～90％時，于細(xì)胞對數(shù)生長期分別轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A質(zhì)粒、空質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染操作過程依照LipofectamineTM2000試劑說明書進行規(guī)范操作。轉(zhuǎn)染操作后24小時給予番茄紅素處理，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。即轉(zhuǎn)染后48小時收集標(biāo)本，用于后續(xù)實驗。
　　3、細(xì)胞丙二醛(MDA)含量檢測<

6、br>　　收集轉(zhuǎn)染后48小時的各組細(xì)胞，使用硫代巴比妥酸(TBA)法測定細(xì)胞MDA水平。操作過程依照試劑說明書進行規(guī)范操作，于532nm處，讀取吸光度值。
　　4、目的蛋白表達(dá)水平檢測——蛋白免疫印跡(Western Blot)提取細(xì)胞總蛋白，以Bicinchoninic acid(BCA)法測定細(xì)胞總蛋白濃度。以60μg為蛋白上樣量，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。之后，將凝膠中的蛋白電泳轉(zhuǎn)印至聚偏二

7、氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜與一抗于4℃搖床孵育至少12小時。再將PVDF膜與結(jié)合有熒光染料的二抗于室溫下避光孵育1小時。之后使用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描，結(jié)合ImageJ軟件進一步確定目的蛋白表達(dá)水平。
　　5、細(xì)胞凋亡率測定
　　消化各組NSC34細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，500rpm，5分鐘條件下離心，棄上清，將細(xì)胞以預(yù)冷的PBS重懸并計數(shù)。取1-5*105個細(xì)胞再次以上述條件離心，

8、棄上清，加入500μl1x Binding buffer重懸，再加入5μlPI，室溫避光孵育30分鐘，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1、成功培養(yǎng)NSC34細(xì)胞，完成質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
　　于倒置熒光顯微鏡下觀察證實，NSC34細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)規(guī)則，突起明顯，成功培養(yǎng)NSC34細(xì)胞。于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A組和番茄紅素處理組的細(xì)胞，證實均存在EGFP綠色熒光;對于轉(zhuǎn)染hSOD

9、1-G93A組和番茄紅素處理組細(xì)胞，蛋白質(zhì)免疫印跡法在相應(yīng)位置檢測到含EGFP標(biāo)簽的外源性SOD1(Fig.5)，流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染效率為23.30％和26.21％，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染完成。
　　2、丙二醛(MDA)含量測定
　　MDA含量代表了細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，可間接反映氧化應(yīng)激水平。收集轉(zhuǎn)染48小時后細(xì)胞，測定MDA，結(jié)果顯示，空白對照組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞MDA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A組細(xì)胞

10、MDA含量明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(P＜0.05)，達(dá)2.25nmol/mgprot。各個番茄紅素處理組（1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L）的MDA含量均不同程度的高于轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A組，分別為1.94 nmol/mgprot、1.46nmol/mgprot、1.30 nmol/mgprot，呈劑量相關(guān)性，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。證實轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A能夠引起NSC34細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷，番茄紅

11、素能夠減輕這種損傷，減輕程度與給藥濃度呈劑量相關(guān)性。
　　3、NQO-1表達(dá)水平測定
　　NQO-1是涉及對抗活性氧損傷的一種關(guān)鍵酶，在氧化應(yīng)激條件下NQO-1的表達(dá)被誘導(dǎo)，為細(xì)胞提供多重保護。NSC34細(xì)胞轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A后24小時給予番茄紅素（7.5μmol/L）、48小時收集細(xì)胞并提取細(xì)胞蛋白用于蛋白質(zhì)免疫印跡，觀測NQO-1蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，相比于空白對照組，轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A組NQO-1蛋

12、白表達(dá)水平明顯下降，為29.85％，番茄紅素處理組（7.5μmol/L）NQO-1蛋白表達(dá)水平為67.01％，明顯高于轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、細(xì)胞凋亡率
　　凋亡中、晚期細(xì)胞以及死亡細(xì)胞，細(xì)胞膜的完整性受到比較嚴(yán)重的破壞，碘化丙啶(PI)可進入細(xì)胞內(nèi)將細(xì)胞核紅染，可用來較為客觀地判定細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A24小時后給予番茄紅素處理（1.5μmol/L、2.5μmol/

13、L、7.5μmol/L），48小時后收集細(xì)胞用于凋亡率檢測。結(jié)果顯示相比于轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A組40.08％的凋亡率，各番茄紅素處理組（1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L）細(xì)胞凋亡率均降低，分別為36.55％、30.15％、24.8％，且降低程度與番茄紅素給藥濃度呈劑量相關(guān)性，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　番茄紅素對轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A的NSC34細(xì)胞有保護作用，主要表現(xiàn)為: