利美尼定對過表達(dá)ALS相關(guān)毒性蛋白質(zhì)NSC34細(xì)胞的干預(yù)研究.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化癥（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種選擇性累及上下運(yùn)動神經(jīng)元為特點(diǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，一般在成年起病，多在起病后的3到5年因致命性呼吸衰竭死亡，目前尚無有效的治愈方法。ALS確切的致病機(jī)制迄今未明，目前研究的熱點(diǎn)是SOD1基因和TDP-43基因突變，這兩個(gè)基因的突變可以使細(xì)胞內(nèi)蛋白異常折疊和聚集，產(chǎn)生運(yùn)動神經(jīng)元變性，從而導(dǎo)致ALS的發(fā)生和發(fā)展。細(xì)胞內(nèi)異常形成和聚集的蛋白主要通過

2、自噬途徑被降解。
　　為了尋找能應(yīng)用于臨床的安全自噬誘導(dǎo)劑，Claudia Rose等人篩查了美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)批準(zhǔn)上市的藥品中發(fā)現(xiàn)利美尼定(rilmenidine)，主要作用于中樞的降壓藥，可樂定的類似物，它在亨廷頓病鼠模型中能夠上調(diào)自噬，減少突變的亨廷頓蛋白的水平。此外，利美尼定還能減輕亨廷頓病鼠模型的疾病癥狀。亨廷頓?。℉untington'sdisease，HD）是由于突變的亨廷頓蛋白在胞內(nèi)異常聚集從而引起神經(jīng)元

3、變性死亡。因此我們?yōu)榱俗C實(shí)利美尼定是否能夠誘導(dǎo)自噬，降解NSC34細(xì)胞內(nèi)與ALS相關(guān)的異常的毒性蛋白。我們在NSC34細(xì)胞系中應(yīng)用利美尼定，通過蛋白免疫印跡(western blotting)的方法來檢測LC3-Ⅱ水平，首先來驗(yàn)證利美尼定是否有誘導(dǎo)自噬的作用。再將WT SOD1、G93A SOD1、WT TDP-43、TDP-25、TDP-35質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NSC34細(xì)胞系構(gòu)建ALS細(xì)胞模型，通過蛋白免疫印跡的方法對比用藥組和空白組中外源性

4、蛋白的表達(dá)水平。最后應(yīng)用特異性自噬抑制劑3-MA（3-methyl adenine，3-MA）證明利美尼定是通過自噬途徑降解細(xì)胞內(nèi)異常聚集的蛋白。綜上，我們的數(shù)據(jù)表明利美尼定可以在ALS細(xì)胞模型中通過自噬途徑清除細(xì)胞中異常的毒性蛋白，可能達(dá)到對神經(jīng)元的保護(hù)作用。這就為以后探索利美尼定在ALS等變性疾病動物模型中保護(hù)性機(jī)制，甚至為后續(xù)變性病的臨床試驗(yàn)研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及SOD1、

5、TDP-43轉(zhuǎn)染NSC34細(xì)胞系的建立NSC34細(xì)胞系是具有很多運(yùn)動神經(jīng)元特性的雜交細(xì)胞系，我們用10％滅活胎牛血清、青霉素及鏈霉素配制的高糖DMEM作為其培養(yǎng)液，使其在37℃、含有5％二氧化碳的溫箱中生長傳代。我們應(yīng)用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將EGFP-WT SOD1、EGFP-G93A SOD1和EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35、MYC-WT TDP-43質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至NSC34細(xì)

6、胞。轉(zhuǎn)染了EGFP-WT SOD1、EGFP-G93ASOD1、EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35、MYC-WT TDP-43質(zhì)粒的f NSC34細(xì)胞在上述培養(yǎng)液中進(jìn)行生長傳代。
　　2.治療藥物與干預(yù)方案將NSC34細(xì)胞分為給藥干預(yù)組和對照組，將利美尼定儲備液配制成1um、5um、10um、20um不同濃度的工作液分別對NSC34細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，利用western blotting的方法檢測NSC34細(xì)胞中LC3及P6

7、2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，來探索利美尼定上調(diào)自噬的最佳作用濃度。把過表達(dá)EGFP-WTSOD1、 EGFP-G93A SOD1、EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35、MYC-WTTDP-43的NSC34細(xì)胞分別分為給藥干預(yù)組和對照組，通過westernblotting的方法檢測細(xì)胞中過表達(dá)蛋白的表達(dá)水平，來觀察利美尼定是否有降解蛋白質(zhì)的作用。應(yīng)用自噬通路特異性阻斷劑3-MA干預(yù)過表達(dá)EGFP-TDP-25的NSC34細(xì)胞，用west

8、ern blotting的方法檢測過表達(dá)蛋白的表達(dá)水平，來進(jìn)一步驗(yàn)證利美尼定是否通過自噬通路降解細(xì)胞內(nèi)異常聚集的蛋白。
　　3.蛋白免疫印跡收集細(xì)胞，提取總蛋白。應(yīng)用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白的濃度，每個(gè)蛋白樣本進(jìn)行10％或12％的鈉十二烷基的硫酸鹽(SDS)聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳，凝膠上蛋白就轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將這些包含有蛋白的PVDF膜與一抗在4℃下孵育過夜。第二天經(jīng)過洗膜后，再與結(jié)合有熒光染料的二抗

9、孵育。最后用Odyssey紅外圖像掃描系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行掃描以確定某一蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.利美尼定對NSC34細(xì)胞中內(nèi)源性蛋白LC3-Ⅱ及P62表達(dá)水平的影響。
　　通過應(yīng)用western blotting檢測NSC34細(xì)胞內(nèi)LC-Ⅱ及P62表達(dá)水平，結(jié)果顯示應(yīng)用1uM、5uM、10uM、20uM的利美尼定干預(yù)NSC34細(xì)胞后LC3-Ⅱ的表達(dá)水平均高于空白對照組，但在利美尼定濃度為10uM時(shí)最明顯，差別

10、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而P62在此條件下下降最明顯，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.利美尼定對ALS疾病相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。
　　我們應(yīng)用的質(zhì)粒帶有EGFP或MYC標(biāo)簽，應(yīng)用抗EGFP抗體或抗MYC抗體檢測各類蛋白質(zhì)的變化。結(jié)果顯示利美尼定降低過表達(dá)EGFP-G93A SOD1、EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35的NSC34細(xì)胞中表達(dá)的外源性蛋白的水平，給藥干預(yù)組和空白對照組差別具有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而對過表達(dá)MYC-WT TDP-43和EGFP-WT SOD1的NSC34細(xì)胞中表達(dá)的外源性蛋白的水平無影響，給藥干預(yù)組和空白對照組的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.自噬通路的特異性阻斷劑3-MA對利美尼定降解蛋白質(zhì)作用的影響。
　　應(yīng)用抗EGFP抗體檢測過表達(dá)EGFP-TDP-25的NSC34細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的外源性TDP-25蛋白，結(jié)果顯示應(yīng)用3-MA和利美尼定干預(yù)組中TDP-25蛋白的

12、表達(dá)水平較單獨(dú)應(yīng)用利美尼定干預(yù)組顯著上升，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.給予利美尼定干預(yù)后，NCS34細(xì)胞內(nèi)源性的自噬泡標(biāo)志分子LC3-Ⅱ表達(dá)水平明顯升高，而介導(dǎo)被降解蛋白與LC3-Ⅱ相連接的自噬流的標(biāo)記分子P62表達(dá)水平明顯下降，證實(shí)了利美尼定具有上調(diào)自噬的作用。
　　2.因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)基因突變引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的異常聚集和折疊，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，可以導(dǎo)致ALS的發(fā)生。我們將與ALS致病

13、相關(guān)的WT SOD1、G93A SOD1、TDP-25、TDP-35、WT TDP-43質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NSC34細(xì)胞內(nèi)，給予利美尼定干預(yù)后過表達(dá)G93A SOD1、TDP-25、TDP-35的NSC34細(xì)胞中外源性蛋白的表達(dá)水平較空白對照組明顯下降，而過表達(dá)的WTSOD1、WT TDP-43的NSC34細(xì)胞中外源性蛋白的表達(dá)水平較空白對照組無明顯差異。因此，我們得出利美尼定可以清除ALS細(xì)胞模型中與致病相關(guān)的毒性蛋白。利美尼定能夠促進(jìn)G93

14、A SOD1、TDP-25、TDP-35的降解，而對WT SOD1以及WT TDP-43沒有降解作用。
　　3.因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)異常聚集的蛋白主要是通過兩個(gè)途徑清除:自噬-溶酶體途徑和泛素化-蛋白酶體途徑，為了證實(shí)利美尼定是通過自噬途徑清除細(xì)胞內(nèi)的毒性蛋白，我們在本實(shí)驗(yàn)中加用特異性自噬通路抑制劑3-MA(3-methyl adenine，3-MA)，將3-MA和利美尼定同時(shí)作用于過表達(dá)TDP-25的NSC34細(xì)胞與利美尼定單獨(dú)作用于過表