ASC-J9對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細胞的作用.pdf

1、神經(jīng)母細胞瘤與12-14天的胚胎期脊髓運動神經(jīng)元雜交,形成了運動神經(jīng)元樣細胞系(NSC)。NSC34具有了運動神經(jīng)元的特征:產(chǎn)生動作電位,表達神經(jīng)絲,合成和釋放乙酰膽堿等。另外,NSC34誘導了共培養(yǎng)肌肉細胞的乙酰膽堿受體,以及在培養(yǎng)成熟過程中經(jīng)歷了微波蛋白到神經(jīng)絲的轉(zhuǎn)變。這樣既克服了原代運動神經(jīng)元培養(yǎng)的費時、費力、花費高等不足,又保留了原代運動神經(jīng)元的特征,是研究肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的常用細胞株。
　　 TDP-43(43

2、-kDa TAR DNA-binding domain protein)是一種在額顳葉變性和ALS病人的泛素陽性包涵體內(nèi)的主要組成成分,然而TDP-43明顯聚集的機制仍不清楚。TDP-43正常存在于細胞的胞核內(nèi),但是在死于ALS病人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,TDP-43由胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至了胞質(zhì),并以彌散分布或者存在于泛素陽性的包涵體內(nèi)。雖然,TDP-43在ALS病人中廣泛存在,但是它的一些確切機制仍不很清楚。例如,Mackenzie等人研究發(fā)現(xiàn),異

3、常分布的TDP-43廣泛存在于大多數(shù)散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化(SALS)和家族性肌萎縮側(cè)索硬化(FALS)病人中,但在SOD1突變的FALS病人中卻沒有發(fā)現(xiàn)。同樣,Robertson等人在2例由SOD1突變導致的FALS病人中雖然發(fā)現(xiàn)泛素陽性的包涵體但沒有找到TDP-43。提示TDP-43的異?？赡芎蚐OD1基因突變的發(fā)病機制不同。
　　 近年在不同的SALS和FALS中先后發(fā)現(xiàn)了TARDBP(transactiveresponse

4、 DNA binding protein)基因的30種突變。目前有證據(jù)顯示,TARDBP基因很可能是繼SOD1基因后發(fā)現(xiàn)的又一種ALS的高突變基因。TARDBP基因位于人類1號染色體lp36.2上,序列高度保守,廣泛表達于多種組織。其6個外顯子編碼TDP-43蛋白(TAR-DNA bindingprotein)。TDP-43在基因的表達調(diào)控方面起著重要作用,包括:通過富含甘氨酸的C'末端與核內(nèi)不均一核糖核蛋白家族成員結(jié)合從而影響外顯子跳

5、躍拼接、抑制剪接活性;與運動神經(jīng)元生存蛋白作用為核體提供支架;參與調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性、microRNA的生物合成、細胞凋亡和分裂;可能是調(diào)節(jié)神經(jīng)元可塑性的神經(jīng)元活性反應因子等。因此,目前對TDP-43在ALS中作用的研究越來越多。本課題在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的基礎上,加入ASC-J9觀察其對細胞LDH和MDA的影響,以了解其對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同TDP-43細胞的作用。
　　 第一部分穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細胞系的培養(yǎng)及其MD

6、A的變化
　　 目的:探索穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細胞系的培養(yǎng)方法及其MDA變化,為進一步研究TDP-43在ALS中的作用創(chuàng)造條件。
　　 方法:參照運動神經(jīng)元樣細胞株的培養(yǎng)程序,將本實驗室現(xiàn)有的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細胞系進行復蘇、傳代、消化、凍存等,觀察其生長和增殖變化。并觀察轉(zhuǎn)染不同TDP-43的NSC34細胞系的MDA的水平。
　　 結(jié)果:成功培養(yǎng)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Empty vector、TD

7、P-43 Wide type、TDP-43 Q331K、TDP-43 M337V四個NSC34細胞系,倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)良好。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43 Q331K細胞系較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Emptyvector細胞系MDA顯著增高,具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43 Wide type和TDP-43 M337V細胞系較Empty vector細胞系MDA顯著增高,具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:穩(wěn)定轉(zhuǎn)

8、染的四個細胞系可以作為研究TDP-43在ALS中作用的一種體外模型;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43 Wide type、TDP-43 Q331K、TDP-43M337V三個細胞系較Empty vector細胞系表現(xiàn)出了顯著的脂質(zhì)過氧化,間接反映其細胞損傷程度更明顯。
　　 第二部分 ASC-J9對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細胞系的影響
　　 目的:研究ASC-J9對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同TDP-43的NSC34細胞系的作用,為進一步研

9、究ASC-J9對ALS的作用創(chuàng)造條件。
　　 方法:在成功培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細胞基礎上,于傳代24小時后進行換液,待細胞恢復6-12小時后,將細胞隨機分為對照組和ASC-J9干預組,對照組給予含10％胎牛血清的普通培養(yǎng)液,ASC-J9干預組分別給予ASC-J90.1、1和5μmol/L作用24小時,作用完全后收集各組培養(yǎng)液及細胞,測定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的含量,測定細胞中丙二醛(MDA)的含量。

10、　　 結(jié)果:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細胞系在給予ASC-J90.1、1和5μmol/L作用24小時后,倒置相差顯微鏡下觀察,各組細胞形態(tài)未見明顯變化。給予ASC-J90.1μmol/L作用24小時后,細胞的MDA、LDH未見明顯變化,給予ASC-J91、5μmol/L作用24小時后,細胞的MDA、LDH較未對照組明顯下降,具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:ASC-J9可明顯降低細胞的MDA和LDH,對于抵抗