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文檔簡(jiǎn)介
1、神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一類慢性的神經(jīng)系統(tǒng)的疾病,主要因腦中特定神經(jīng)元的壞死和退變引起的。大多數(shù)的神經(jīng)退行性疾病都有一個(gè)共同的特征:在病人的腦中,突變的蛋白在細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)異常的聚集,形成聚集體或包涵體。例如,與肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis,簡(jiǎn)稱ALS)相關(guān)的致病蛋白TAR DNAbinding protein-43(TDP-43),在病人
2、的腦細(xì)胞內(nèi)被檢測(cè)到突變的TDP-43蛋白形成的聚集體等。
肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥是神經(jīng)退行性疾病的一種。分為家族遺傳性和散發(fā)性兩種?;蜓芯恳汛_定常染色體顯性遺傳型與銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變有關(guān),這些基因突變患者僅占家族遺傳性病例的20%。TDP-43是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與遺傳性和散發(fā)性ALS以及其他一些神經(jīng)退行性疾病發(fā)病相關(guān)的蛋白,目前TDP-43蛋白被認(rèn)為是除SOD1外引起ALS的一種主要致病蛋白。突變的TD
3、P-43蛋白在細(xì)胞的胞漿中形成泛素化的聚集。這個(gè)聚集被認(rèn)為是有毒性的,它可能導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡,攜帶突變TDP-43基因的轉(zhuǎn)基因鼠具有與人類ALS極為相似的癥狀。因此對(duì)TDP-43蛋白降解機(jī)制的研究對(duì)我們研究ALS的發(fā)病機(jī)制有著重要的意義。
本文主要通過對(duì)野生型的TDP-43蛋白和病理突變的25KD的TDP一43(TDP-25)蛋白的降解途徑進(jìn)行探討,揭示了其具體降解途徑,主要研究結(jié)果如下:
我們先將與綠色熒光
4、蛋白相嵌合的野生型的TDP-43蛋白(GFP-TDP-43)和病理突變的TDP-43蛋白(GFP-TDP-25)分別轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中,用MG132處理后,將細(xì)胞收集下來檢測(cè)TDP-43和病理突變的TDP-25的蛋白量的變化。我們發(fā)現(xiàn):加了MG132的實(shí)驗(yàn)組,其蛋白降解受到抑制,且病理突變的TDP-25的現(xiàn)象遠(yuǎn)比野生型的TDP-43蛋白明顯,同時(shí),內(nèi)源性的TDP-43蛋白降解也受到影響。另外,免疫共沉淀的結(jié)果顯示,病理突變的TDP
5、-25的泛素化程度比野生型的TDP-43強(qiáng)。細(xì)胞免疫熒光化學(xué)的結(jié)果也顯示,MG132處理后,TDP-43和病理突變的TDP-25在細(xì)胞內(nèi)的聚集都明顯增加。說明野生型的TDP-43和病理突變的TDP-25都可以通過泛素蛋白酶體途徑降解。
在細(xì)胞內(nèi),我們發(fā)現(xiàn)溶酶體標(biāo)志蛋白,LC3(RFP-LC3)與GFP-TDP-25有共定位的現(xiàn)象。這提示我們TDP-43蛋白可能通過溶酶體途徑降解。
為了進(jìn)一步揭示野生型的TDP
6、-43和TDP-25是否通過溶酶體途徑降解,我們分別用溶酶體降解途徑的抑制劑3-MA/pepstaineA和促進(jìn)劑Trehalose處理,發(fā)現(xiàn)3-MA/pepstaineA處理后,蛋白降解受到抑制,且TDP-25遠(yuǎn)比野生型的TDP-43明顯。同時(shí),Trehalose處理后,蛋白降解加快,TDP-25降解比TDP-43明顯。
通過以上實(shí)驗(yàn),我們得出結(jié)論:野生型的TDP-43和病理突變的TDP-25既能通過泛素蛋白酶體途徑降解
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