EGCG對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP43 Q331K的NSC34細(xì)胞系的作用.pdf

1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤與胚胎期的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元雜交,形成了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞系,其中NSC34細(xì)胞株既克服了原代運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、花費(fèi)高等不足,又保留了原代運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的特征,是研究肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的常用細(xì)胞株。
　　 TDP43是一個(gè)由1號(hào)染色體編輯的TARDNA結(jié)合蛋白,分子量為43KDa。2006年,在額顳葉癡呆和肌萎縮側(cè)索硬化的泛素陽性的包涵體中發(fā)現(xiàn)TDP43。由此,TDP43在變性疾病中的作用引起了高度關(guān)注。TDP43

2、正常存在于細(xì)胞的胞核內(nèi),但是在死于ALS的病人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,TDP43由胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至了胞質(zhì)內(nèi),并彌散分布于泛素陽性的包涵體內(nèi)。
　　 近兩年在不同的散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化(SALS)和家族性肌萎縮側(cè)索硬化(FALS)中先后發(fā)現(xiàn)了TARDBP(transactive response DNA bindingprotein)基因的30種突變。TARDBP基因很可能是繼SOD1基因后發(fā)現(xiàn)的又一種ALS的高突變基因。本課題在觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)

3、染不同TDP43對(duì)NSC34細(xì)胞影響的基礎(chǔ)上,加入EGCG觀察EGCG對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP43Q331K細(xì)胞的作用。
　　 第一部分四種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同TDP43的NSC34細(xì)胞系的培養(yǎng)及其LDH的變化
　　 目的:探索穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同TDP43的神經(jīng)元樣細(xì)胞株NSC34細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其LDH變化,為進(jìn)一步研究TDP43與肌萎縮側(cè)索硬化的關(guān)系和肌萎縮側(cè)索硬化的防治創(chuàng)造條件。
　　 方法:使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Empty vecto

4、r、TDP43 Wide type、TDP43 Q331K、TDP43 M337V四個(gè)NSC34細(xì)胞系。此四種細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,采用脂質(zhì)體將四種不同的TDP43轉(zhuǎn)入運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞株NSC34細(xì)胞,參考培養(yǎng)NSC34細(xì)胞株的方法進(jìn)行培養(yǎng),采用抗生素加壓篩選,進(jìn)而挑選單克隆細(xì)胞,采用熒光免疫技術(shù)鑒定,將單克隆細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)、傳代、并置于液氮中凍存。
　　 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Empty vector、TDP43 Wide tvpe、TD

5、P43 Q331K、TDP43M337V四個(gè)NSC34細(xì)胞系各一支從液氮中取出,擦酒精后拿入培養(yǎng)室,于37℃水浴箱中晃動(dòng)使之迅速融化,移至離心管中,加入含10％血清的DMEM培養(yǎng)基,離心,去上清,加入含10％血清的DMEM培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液,接種于25cm2一次性塑料培養(yǎng)瓶。將瓶蓋旋至半松狀態(tài),放入37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 將成功培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP43 NSC34細(xì)胞傳代,接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),接種密度10

6、000/孔,于傳代24小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞形態(tài)恢復(fù),突起明顯,生長狀態(tài)良好,換液,再待細(xì)胞恢復(fù)24d,時(shí)后,收集各組培養(yǎng)液及細(xì)胞,測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的含量。
　　 結(jié)果:成功培養(yǎng)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Empty vector、TDP43 Wide type、TDP43Q331K、TDP43 M337V四個(gè)NSC34細(xì)胞系。使用胰酶消化細(xì)胞,并以25萬/瓶密度接種,2-3天后細(xì)胞80％～90％融合,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良

7、好。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP43 Q331K、TDP43 Wide type和TDP43 M337V細(xì)胞系較Empty vector細(xì)胞系的LDH水平顯著增高,P＜0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP43 Q331 K細(xì)胞系的LDH水平較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Empty vector、TDP43 Wide type和TDP43 M337V細(xì)胞系的LDH顯著增高,P＜0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Empty vector TDP43

8、,Wide type TDP43,Q331KTDP43,M337V TDP43四個(gè)NSC34細(xì)胞系在正常的培養(yǎng)狀態(tài)下表現(xiàn)出了不同的脂質(zhì)過氧化程度。TDP43 Q331K細(xì)胞系細(xì)胞膜過氧化程度明顯增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。突變型TDP43 Q331K現(xiàn)出了更明顯的過氧化,間接反映了其細(xì)胞膜損傷程度更明顯。
　　 第二部分 EGCG對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的TDP43 Q331K NSC34細(xì)胞系的影響
　　 目的:研究EGC

9、G對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP43 Q331K NSC34細(xì)胞系的作用,為進(jìn)一步探索EGCG預(yù)防和治療肌萎縮側(cè)索硬化的作用。
　　 方法:將成功培養(yǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP43 Q331K NSC34細(xì)胞傳代,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。接種密度3000/孔,傳代24小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞形態(tài)恢復(fù),突起明顯,生長狀態(tài)良好。更換新的培養(yǎng)液,再待細(xì)胞恢復(fù)6-12小時(shí)后,將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和EGCG干預(yù)組。選用5μmol/L EGCG作用48小時(shí)

10、,作用完全后收集各組培養(yǎng)液,測(cè)定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的含量。
　　 結(jié)果:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染突變型TDP43的NSC34細(xì)胞系在給予EGCG5μmol/L作用48小時(shí)后,倒置相差顯微鏡下觀察,細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化;干預(yù)組細(xì)胞的培養(yǎng)液中LDH的水平較未干預(yù)組明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:EGCG對(duì)于抵抗TDP43突變對(duì)細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷發(fā)揮了一定作用,進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。由此推測(cè)EGCG在肌萎縮