生物人工肝支持系統(tǒng)中關鍵項目的評價技術和質量標準研究.pdf

1、目的：
　　1.評價生物人工肝生物反應器中用海藻酸鈉/殼聚糖微囊(AC微囊)的安全性和預期生物功能，為制定質量標準提供技術依據(jù)。
　　2.評價用于生物人工肝支持系統(tǒng)中肝細胞的活性、合成和藥物代謝功能;探索性考察Gal抗原缺失肝細胞與野生型動物肝細胞功能性基因表達的差異，為動物源性肝細胞用于生物人工肝的可能性評價提供基礎數(shù)據(jù)。
　　3.評價生物人工肝支持系統(tǒng)中血泵分離裝置的血細胞損傷（溶血性能），建立連續(xù)流血泵評價溶血性

2、試驗的標準方法，為行業(yè)標準的制定提供技術依據(jù)。
　　方法：
　　1.根據(jù)李蘭娟院士人工肝課題組提供的一步法制備AC微囊，并對AC微囊進行表面結構、密度、免疫阻隔、降解性、機械強度和物質通透性等進行物理表征，通過AC微囊的細胞毒性、溶血性和熱原性進行評價，考察其生物相容性。
　　2.采用HepG2細胞為實驗對象，模擬其預期臨床使用方式，用AC微囊包裹肝細胞，評價將用于生物人工肝支持系統(tǒng)中肝細胞活性、合成和藥物代謝功能。采

3、用Realtime-PCR技術對Gal抗原缺失動物肝細胞與野生型動物肝細胞功能性基因表達的差異進行評價。
　　3.在一定循環(huán)管路及血泵工作條件下，采用氰化高鐵血紅蛋白法檢測血漿中游離血紅蛋白的量，考察血泵循環(huán)動力因素對紅細胞潛在破壞作用即溶血性能評價。
　　結果：
　　1.制備AC微囊粒徑為800～1000μm，呈球狀、大小均一、SEM顯示微囊有微孔洞;密度為（1.39±0.155）g/mL。在180 r/min振蕩下

4、24h后其完整率在95％以上;微囊通透性試驗顯示10min時人血清白蛋白釋放率約為50％，90 min左右蛋白達到了平衡狀態(tài);免疫分子無法進入AC微囊中;模擬生物反應器經(jīng)12h后，微囊形貌變化較小，介質pH值隨著時間的增加而增加，特征峰的譜帶強度明顯減弱，說明靜電相互作用減弱，分子鍵開始發(fā)生斷裂，即作用3d的微囊發(fā)生一定程度的降解;MTT試驗結果可以看出，用浸提液培養(yǎng)的細胞相對活性為97％左右，LDH試驗中，微囊浸提液樣品組的檢測OD值

5、為(0.381±0.035)，細胞毒性評價(MTT、LDH)的結果顯示微囊浸提液與空白組相比細胞的相對活性沒有顯著性差異。微囊浸提液內毒素含量小于5U/mL;血液相容性評價直接法的溶血率為（1.36±0.211）％;浸提法的溶血率為（2.69±0.219）％。在8h內微囊殘留DNA的量126 ng/mL，72 h后DNA的量約為572.122 ng/mL。
　　2.包裹的肝細胞均勻分布在微囊內，培養(yǎng)48 h后細胞生長狀態(tài)良好，死細

6、胞數(shù)目極少;微囊化肝細胞在24h內氨代謝約為（312.43±88.16）ng/106細胞，24 h后每106個細胞的氨代謝能力逐漸增加;與未包裹的肝細胞相比其白蛋白和尿素合成量均有所提高，且隨著時間遞增微囊化培養(yǎng)的肝細胞CYP1A2活性提高約5倍，CYP3A4活性提高大于3倍;
　　3.當iGB3S基因和GGTA1基因單敲或雙敲時中肝藥酶相關基因CYP1a1、CYP2b10、CYP3a和CYP4a14基因表達上調，促進藥物代謝途徑

7、，糖基轉移酶相關基因ST3Gal1、ST3Ga13、ST6Gal1和Neu5Ac基因的表達上調，說明敲除型小鼠中mRNA表達反應蛋白活性增加，仍有其他異源抗原的表達。
　　4.建立血泵裝置的溶血性評價方法，增加了氰化高鐵血紅蛋白檢測法，血泵裝置的溶血試驗中各個時間點的修正溶血指數(shù)大于0.1，因此該血泵的泵速等因素可對紅細胞造成明顯的破壞作用;
　　結論：
　　1.采用一步法制備的AC微囊，具有良好的通透性和機械強度，具

8、有一定的免疫隔離作用，在一定時間內無溶血性、無熱原反應。
　　2.對微囊化的細胞采用系統(tǒng)評價方法，包括細胞毒性評價、代謝活性和藥物解毒功能評價。其結果顯示，包裹的肝細胞均勻分布在微囊內，并且與未包裹的肝細胞相比其白蛋白、尿素合成量及P450活性均有所提高。
　　3.Realtime-PCR結果表明Gal抗原缺失型動物肝細胞的肝藥酶基因表達水平輕度上調，說明基因敲除動物肝細胞對肝藥酶無負面影響，甚至基因表達水平輕度增高，可能有

9、利于促進藥物代謝;但也有部分基因表達下調，這也可能是在生物代謝途徑中受到多種代謝通路的調控，還有待深入研究。
　　4.在一定循環(huán)管路及血泵工作條件下，血泵循環(huán)動力因素對紅細胞具有較大的影響，對血細胞的破壞程度高，說明對血泵進行溶血性評價至關重要;但臨床上對泵速的要求不同，還有待深入研究。
　　研究成果
　　1.對生物人工肝中使用的微囊材料進行物理表征、生物學評價和體外細胞毒性評價，為建立生物人工肝支持系統(tǒng)中微囊化細胞培