20(S)-人參皂苷Rg3對肝癌細胞自噬介導的索拉非尼敏感性影響的實驗研究.pdf

1、目的:通過細胞實驗探索20(S)-人參皂苷Rg3(Rg3)對肝癌細胞自噬介導的索拉非尼藥物敏感性的影響，并研究其機制，為臨床聯合藥物治療肝癌提供理論參考。
　　方法:以人肝癌細胞株Hep3B為觀察對象，分別接受Rg3、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)索拉非尼、Rg3+索拉非尼和3-MA+索拉非尼處理，采用MTT法檢測Hep3B細胞對Rg3、索拉非尼及3-MA的敏感性;CCK-8法檢測Rg3、3-MA分別聯合不同濃度索拉非尼后對

2、Hep3B細胞的增殖抑制作用，q值判斷聯合用藥效果;細胞克隆形成實驗檢測各組藥物對Hep3B細胞的增殖抑制率;利用倒置熒光顯微鏡（丫啶橙染色）及透射電鏡觀察各組細胞內自噬體的數量;LC3 Conversion實驗及LC3 Turnover實驗檢測Rg3和索拉非尼對Hep3B細胞自噬的影響;Western blotting檢測Rg3和索拉非尼對自噬相關蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、p62水平的影響。
　　結果:1.MT

3、T結果顯示，Rg3、索拉非尼及3-MA對肝癌細胞株Hep3B的增殖抑制呈明顯的“量效關系”和“時效關系”。2.CCK-8結果顯示:低、中、高濃度索拉非尼聯合Rg3前后的抑制率均有統計學差異(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)。低、中濃度索拉非尼聯合3-MA前后亦有顯著差異(P＜0.01)，但高濃度與之聯合前后差異不明顯(P＞0.05)。q值計算結果顯示:低、中濃度索拉非尼聯合Rg3及3-MA后表現為協同作用;高濃度與其聯合后表現

4、均為相加作用。3.細胞克隆形成實驗結果顯示，與對照組相比，索拉非尼單藥增殖抑制率明顯高于對照組(P＜0.01)，Rg3和3-MA抑制不明顯(P＞0.05)，索拉非尼聯合Rg3或3-MA增殖抑制率均高于索拉非尼單藥(P＜0.05)。4.倒置熒光顯微鏡和透射電鏡顯示，與對照組相比，Rg3組、素拉非尼組細胞自噬體數量明顯增加，但3-MA組增加不明顯，索拉非尼聯合3-MA后自噬體數量明顯減少，但聯合Rg3后減少不顯著。5.LC3 Convers

5、ion實驗結果顯示:隨著藥物作用時間(0h、8h、16h、24h)的延長，Rg3及索拉非尼均使Hep3B細胞株LC3-Ⅱ蛋白水平不斷升高;LC3 Turnover實驗結果顯示:索拉非尼聯合氯喹(CQ)作用24h后，LC3-Ⅱ蛋白水平明顯升高(P＜0.01)，而Rg3聯合CQ前后LC3-Ⅱ水平無明顯差異(P＞0.05)。6.Western-blotting結果顯示:與對照組相比，Rg3、索拉非尼均可使Beclin1蛋白表達升高(P＜0.0

6、1)，而3-MA對Beclin1表達無影響(P＞0.05)，索拉非尼聯合3-MA后Beclin1水平明顯降低（P＜0.01），而聯合Rg3后下降不明顯(P＞0.5)。Rg3、3-MA及索拉非尼均可使LC3-Ⅱ水平升高(P＜0.01; P＜0.05; P＜0.01)，索拉非尼聯合Rg3后LC3-Ⅱ水平高于索拉非尼單藥(P＜0.01)，而索拉非尼聯合3-MA前后LC3-Ⅱ水平無明顯變化(P＞0.05)。3-MA、索拉非尼組p62蛋白水平明顯

7、低于對照組(P＜0.01;P＜0.05)，而Rg3對其水平無明顯影響(P＞0.05)，索拉非尼聯合Rg3后p62水平明顯升高(P＜0.01)，聯合3-MA后水平明顯降低(P＜0.01)。
　　結論:1.索拉非尼可通過增加Beclin1的表達誘導肝癌細胞自噬，從而導致其藥物敏感性下降。2.低濃度的Rg3對肝癌細胞的增殖抑制不明顯，但可增加索拉非尼的敏感性，其機制是通過抑制肝癌細胞自噬降解活性來實現的，值得進一步研究。3.本研究為索拉