人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及聯(lián)合對(duì)肝癌細(xì)胞c-Met-MAPK通路影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過體外實(shí)驗(yàn)觀察人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及聯(lián)合對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的作用，從分子生物學(xué)水平揭示不同用藥方式對(duì)肝細(xì)胞癌c-Met/MAPK通路的影響，指導(dǎo)臨床實(shí)踐。
　　方法:應(yīng)用不同濃度的人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株HepG2，采用不同的實(shí)驗(yàn)方法觀察細(xì)胞株的生長(zhǎng)狀況:(1)通過MTT法觀察不同濃度的人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及聯(lián)合體外對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的影響;用人肝細(xì)胞生

2、長(zhǎng)因子(HGF)激活c-Met通路，檢測(cè)上述藥物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖作用的改變。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及聯(lián)合體外對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡的影響;用人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)激活c-Met通路，檢測(cè)上述藥物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響。(3)細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)各組通路相關(guān)蛋白c-Met、p-c-Met、Raf、 p-Raf、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK的表達(dá)情況。(4)細(xì)胞免疫印記(Western

3、blotting)法檢測(cè)各組c-Met、p-c-Met、Raf、 p-Raf、 MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1) MTT結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及聯(lián)合對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用，該抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性;兩藥聯(lián)合較單藥有更好的抑制作用，聯(lián)合各組均表現(xiàn)為協(xié)同作用;一定濃度范圍的HGF作用于HepG2細(xì)胞后可促進(jìn)細(xì)胞增殖，該作用在一定范圍內(nèi)呈劑量、時(shí)間依賴性;采用

4、對(duì)細(xì)胞增殖能力影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的低濃度HGF仍會(huì)降低索拉非尼組的抑制率，低濃度人參皂苷Rg3聯(lián)合索拉非尼后可再次提高抑制率，逆轉(zhuǎn)HGF的作用。(2)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥或聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡率均有抑制作用，其中兩藥聯(lián)合比單藥有更好的抑制作用，聯(lián)合各組均表現(xiàn)為協(xié)同作用;一定濃度范圍的HGF作用于HepG2細(xì)胞后可降低抑制率，采用對(duì)細(xì)胞增殖能力影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的低濃度HGF仍會(huì)降低索拉非尼組的凋亡率，低濃度

5、人參皂苷Rg3聯(lián)合索拉非尼后可以逆轉(zhuǎn)HGF的作用，提高凋亡率。(3)細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥或聯(lián)合處理HepG2細(xì)胞后，c-Met的表達(dá)較對(duì)照組并無明顯改變;p-c-Met、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK較空白對(duì)照組顯著降低，且兩藥聯(lián)用組較單藥組降低更為明顯;HGF激活c-Met通路后，c-Met的表達(dá)未見明顯改變，而p-c-Met、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK表達(dá)趨勢(shì)一致，表現(xiàn)為:HGF組比

6、空白對(duì)照組升高，索拉非尼+HGF組較單純索拉非尼組升高，索拉非尼+HGF+人參皂苷Rg3組較索拉非尼+HGF組降低。(4)細(xì)胞免疫印記(Western blotting)法顯示，人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥或聯(lián)合處理HepG2細(xì)胞后，c-Met的表達(dá)較對(duì)照組并無明顯改變;p-c-Met、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK較空白對(duì)照組顯著降低，且兩藥聯(lián)用組較單藥組降低更為明顯，表現(xiàn)為協(xié)同作用;HGF激活c-Met通路后，c-Met的表

7、達(dá)未見明顯改變，而HGF組p-c-Met、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK表達(dá)較對(duì)照組升高;索拉非尼+HGF組p-c-Met、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)較單純索拉非尼組升高，索拉非尼+HGF+人參皂苷Rg3組p-c-Met、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)量較索拉非尼+HGF組降低。
　　結(jié)論:人參皂苷Rg3、索拉非尼單藥及聯(lián)合后能有效抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖;低濃度人參皂苷Rg3可

8、以增加HepG2細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性。兩藥單用或聯(lián)合可以降低HepG2細(xì)胞p-c-Met、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)， HGF可以降低二藥對(duì)HepG2細(xì)胞p-c-Met、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)的抑制作用，人參皂苷Rg3聯(lián)合索拉非尼后p-c-Met、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)較索拉非尼單藥組降低，表明人參皂苷Rg3、索拉非尼抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用以及人參皂苷Rg3增加Hep