20(S)-人參皂苷Rg3對(duì)肝癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的索拉非尼敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探索HepG2細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)對(duì)索拉非尼、20(S)-人參皂苷Rg3單藥及聯(lián)合敏感性的影響及其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用中藥逆轉(zhuǎn)肝癌靶向藥物耐藥提供理論依據(jù)。
　　方法:(1)采用TGFβ1誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2發(fā)生EMT，建立HepG2/EMT細(xì)胞;觀察該過程中細(xì)胞形態(tài)的改變，并檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況。(2)用MTT法檢測索拉非尼、20(S)-人參皂苷Rg3單藥及聯(lián)合對(duì)兩種細(xì)胞增殖的影

2、響;分別檢測HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)胞對(duì)索拉非尼聯(lián)合不同濃度20(S)-人參皂苷Rg3的敏感性。流式細(xì)胞術(shù)檢測索拉非尼、20(S)-人參皂苷Rg3單藥及兩藥聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)胞的周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡作用。Western blotting法檢測索拉非尼和20(S)-人參皂苷Rg3對(duì)EMT相關(guān)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Ras/Raf/MEK/ERK通路蛋白的影響。
　　結(jié)果:1.TGFβ1能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞

3、發(fā)生EMT，在此過程中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(0h、24h、48h、72h)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)降低、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)上升(P＜0.01，P＜0.01);細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生變化，“觸角”明顯變長。2.MTT結(jié)果顯示:索拉非尼、20(S)-人參皂苷Rg3單藥及聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)胞具有增殖抑制作用，且呈現(xiàn)顯著的時(shí)效量效關(guān)系，聯(lián)合組強(qiáng)于單藥組(P＜0.05)。索拉非尼低濃度組對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)胞抑制率差

4、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05)。不同濃度20(S)-人參皂苷Rg3對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)胞抑制率差異無規(guī)律性。索拉非尼分別與三個(gè)不同濃度20(S)-人參皂苷Rg3組聯(lián)合在HepG2細(xì)胞中表現(xiàn)為協(xié)同作用，在HepG2/EMT細(xì)胞中表現(xiàn)為相加作用，聯(lián)合后較單藥后抑制作用增強(qiáng)(P＜0.01)。索拉非尼分別與三個(gè)不同濃度20(S)-人參皂苷Rg3聯(lián)合對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)胞抑制率差異

5、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01)，隨著20(S)-人參皂苷Rg3聯(lián)合濃度的升高對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)胞的抑制率增強(qiáng)(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01)。聯(lián)合濃度組均對(duì)HepG2/EMT細(xì)胞抑制作用減弱(P＜0.01,P＜0.01，P＜0.01)。3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果:TGFβ1誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2發(fā)生EMT前后細(xì)胞周期均在G1期。索拉非尼、兩藥聯(lián)合將HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)

6、胞阻滯在G1期;20(S)-人參皂苷Rg3將HepG2細(xì)胞阻滯在G1期，將HepG2/EMT細(xì)胞阻滯在S期。HepG2發(fā)生EMT后自然凋亡率降低。索拉非尼、20(S)-人參皂苷Rg3單藥誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的凋亡率低于兩藥聯(lián)合(P＜0.01);HepG2/EMT細(xì)胞中，索拉非尼、20(S)-人參皂苷Rg3誘導(dǎo)凋亡率降低(P＜0.01，P＜0.01)，兩藥聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.01)。4.Western blott

7、ing結(jié)果:索拉非尼、20(S)-人參皂苷Rg3單藥及聯(lián)合對(duì)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá)的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT后，Ras、Raf、pMEK、pERK1/2蛋白上調(diào)(P＜0.05);MEK、ERK1/2蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。索拉非尼、20(S)-人參皂苷Rg3能夠抑制HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)胞中Ras、Raf、 pMEK、pERK1/2蛋白表達(dá)，索拉非尼較2

8、0(S)-人參皂苷Rg3抑制作用強(qiáng)(P＜0.05)，聯(lián)合后抑制作用較單藥增強(qiáng)(P＜0.05,P＜0.05)。索拉非尼、20(S)-人參皂苷Rg3單藥及聯(lián)合對(duì)HepG2/EMT細(xì)胞中Ras、Raf、 pMEK、pERK1/2蛋白表達(dá)抑制作用減弱(P＜0.05,P＜0.05，P＜0.05,P＜0.05)。HepG2/EMT細(xì)胞中兩藥聯(lián)合組MEK蛋白表達(dá)較索拉非尼單藥組降低(P＜0.05)，與20(S)-人參皂苷Rg3單藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

9、P＞0.05)。兩藥聯(lián)合組ERK1/2蛋白表達(dá)較20(S)-人參皂苷Rg3單藥組低(P＜0.05)，與索拉非尼單藥組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.索拉非尼對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)胞均具有增殖抑制作用。HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT后，對(duì)索拉非尼敏感性降低。與20(S)-人參皂苷Rg3聯(lián)合后抑制作用明顯增強(qiáng)，20(S)-人參皂苷Rg3可以提高HepG2/EMT細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性。2.索拉非尼對(duì)HepG

10、2/EMT細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用減弱，當(dāng)與聯(lián)合20(S)-人參皂苷Rg3后，誘導(dǎo)凋亡的作用明顯增強(qiáng)，表明20(S)-人參皂苷Rg3能夠促進(jìn)索拉非尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高HepG2/EMT細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感性。3.索拉非尼能抑制HepG2細(xì)胞和HepG2/EMT細(xì)胞Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，但對(duì)前者作用強(qiáng)于后者，這與HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT后Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路異常活化有關(guān)。當(dāng)索拉非尼聯(lián)合20(S)-人