NKX2-5、TBX5和GATA4基因多態(tài)性與廣西壯、漢族人群先天性心臟病關系及其功能驗證.pdf

1、目的：
　　NKX2-5、GATA4和TBX5是目前研究較多的與先天性心臟病(Congenital heart disease，CHD)相關的主要心臟轉錄因子，從胚胎發(fā)育開始，GATA4、NKX2-5和TBX5等多種轉錄因子通過單獨或者相互作用共同影響心臟的形成過程。有研究發(fā)現，NKX2-5、GATA4和TBX5等轉錄因子的缺失或者異常將影響相關通路的表達和心肌的發(fā)育，從而導致室間隔缺損(Ventricular septal de

2、fect，VSD)、房間隔缺損（Atrial septal defect，ASD)等先天性心臟病的發(fā)生。本課題將研究NKX2-5、GATA4和TBX5基因單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）與廣西壯族、漢族人群CHD遺傳易感性的關系，并對CHD的相關位點進行功能驗證。
　　方法：
　　采用以醫(yī)院為基礎的病例對照研究方法。納入廣西壯族、漢族ASD病例68例、VSD病例158例；

3、納入非心臟相關疾病患者234例做為對照組，以年齡、性別和民族對兩組進行頻數匹配。運用流行病學現場調查方法獲取研究對象的基本情況與病歷信息，采集其外周血并提取基因組DNA。通過美國國家環(huán)境健康科學研究所（National Institute of Environmental Health Sciences，NIEHS）數據庫對NKX2-5、GATA4和TBX5基因SNP進行篩選，獲得符合要求的多態(tài)性位點分別為NKX2-5：rs688277

4、6，TBX5：rs11067101、rs883079、rs3782467，GATA4：rs867858、rs904018、rs804287、rs4841588。選用TaqMan-MGB實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）法對所有位點進行基因分型。使用SPSS18.0軟件分析相應位點SNP與CHD遺傳易感性的關系

5、，所用統(tǒng)計方法包括t檢驗、χ2檢驗和多因素Logistic回歸模型。利用軟件Haploview4.2對每個位點的對照組樣本進行哈迪-溫伯格平衡（hardy-weinberg equilibrium，HWE）檢驗。對實驗中發(fā)現的與CHD遺傳易感性有統(tǒng)計學關聯的位點，通過microRNA.org數據庫(http://www.microrna.org/)進行功能預測，若是微小RNA（microRNA，miRNA）潛在靶位點，利用網站http:

6、//snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.htm及SNPInFO軟件對有潛在作用的miRNA進行篩選。最后通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證該位點對篩選出的miRNA的靶向結合作用。
　　結果：
　　（1）納入對象情況：納入的病例和對照在年齡和民族的分布無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），性別的分布差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.007），但VSD組和對照組在年齡、性別和民族的分布差異均無統(tǒng)計學差異（

7、均有P＞0.05）。（2）HWE檢驗：經HaploView4.2軟件檢驗，位點rs904018對照組基因型頻率不符合HWE（χ2=126.39，P=0.000），其他位點的對照組基因型頻率均符合HWE（均有P＞0.05）。
　?。?）基因型頻率與CHD發(fā)病風險關系：經統(tǒng)計分析，位點rs4841588基因型GT/TT能增加CHD的發(fā)病風險，rs867858位點基因型AC/CC能增加CHD的發(fā)病風險，也能單獨增加ASD的發(fā)病風險。而r

8、s883079位點基因型CT/TT能降低CHD的發(fā)病風險，也能單獨降低ASD和VSD的發(fā)病風險。未發(fā)現其他多態(tài)性位點與CHD的發(fā)病風險相關聯。
　?。?）民族、性別分層分析：以民族和性別作為分層變量進行分析，發(fā)現位點rs4841588、rs867858和rs883079的基因型頻率與CHD的發(fā)病風險的關聯有統(tǒng)計學意義。
　?。?）交互作用分析：經統(tǒng)計，rs804287和rs11067101位點之間（OR=0.877，95％

9、CI：0.784~0.981,P=0.021）、rs4841588和rs867858位點之間（OR=1.082，95%CI：1.005~1.163,P=0.035）存在基因-基因交互作用。
　?。?）雙熒光素酶檢測實驗：功能驗證實驗結果顯示，轉入miR375 mimic野生質粒組的相對熒光素酶活性值為：21.35±1.47；未轉入mimic的野生質粒組為：22.95±0.96；轉入miR375 mimic的突變型質粒組為：24.1