X線及基因沉默對人血管內皮細胞BRCA1、p21表達和細胞周期的影響.pdf

1、目的：
　　采用6MV X線照射人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell， HUVEC）以及RNA干擾技術(RNA interference，RNAi)沉默內皮細胞的乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene1, BRCA1）后，觀察對細胞BRCA1和p21基因表達，細胞周期停滯及細胞凋亡的影響,探討“BRCA1-p21-細胞周期”軸在放

2、射性心臟損傷發(fā)揮保護作用的可能性。
　　方法：
　　1.通過免疫蛋白印跡（Western blot）檢測HUVEC在總照射劑量為20Gy的X線照射0、2、4、6、8、10、24、48h后，BRCA1和p21蛋白表達量改變。再檢測HUVEC在劑量梯度為0、2、4、6、8、10、12、20Gy的X線照射后4h， BRCA1和p21蛋白表達量改變。
　　2.流式細胞儀檢測HUVEC在總照射劑量為20Gy的X線照射0、2、4、

3、6、8、10、24、48h后細胞周期分布。再檢測HUVEC在劑量梯度為0、2、4、6、8、10Gy的X線照射后24h細胞周期分布。
　　3.設計并化學合成針對BRCA1的3對小干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)，采用陽離子脂質體法進行瞬時轉染。設正常組、siRNA對照組以及siRNA-BRCA1-4341、siRNA-BRCA1-951、siRNA-BRCA1-410轉染組。
　　4.通過

4、Western blot檢測轉染后各組細胞中BRCA1蛋白表達水平，選擇沉默有效的siRNA序列用于后續(xù)實驗。
　　5.通過Western blot檢測正常組、siRNA對照組及有效沉默組細胞在下調BRCA1后，p21蛋白表達量改變。
　　6.運用流式細胞儀檢測細胞轉染前后細胞周期分布和細胞凋亡變化。
　　結果：
　　1. Western blot顯示HUVEC中BRCA1及p21蛋白的表達隨照射后時間的延長而逐

5、漸增加，而且p21在放射線照射后4小時異常表達升高；HUVEC細胞照射4h后，BRCA1及p21蛋白的表達隨照射劑量的增加而逐漸增加。
　　2.流式細胞儀檢測結果顯示，HUVEC細胞周期阻滯隨照射時間的增加而逐漸明顯，在照射后24h開始出現(xiàn)明顯的G2期阻滯；HUVEC照射后細胞G2期阻滯隨照射劑量的增加逐漸明顯。
　　3.3個特異性BRCA1-siRNAs轉染組分別轉染48h后，BRCA1的蛋白表達水平與正常組及陰性對照組比

6、較出現(xiàn)下降，三個片段均顯示可以有效沉默BRCA1蛋白的表達，而且siRNA-BRCA1-951、siRNA-BRCA1-410轉染組明顯抑制BRCA1表達并顯著下調p21蛋白的表達。
　　4.流式細胞儀檢測顯示，BRCA1-siRNAs轉染組HUVEC的細胞周期G2期阻滯減少，凋亡率增高。
　　結論：
　　1. HUVEC在X線照射后BRCA1和p21蛋白表達明顯增加，細胞被阻滯于G2期。
　　2. HUVEC在