Rh-EPO干預早產兒腦白質損傷模型鼠的作用及機制研究.pdf

1、目的：腦室周圍白質損傷（periventricular white matter damage，PWMD）是早產兒腦損傷的主要神經病理學形式，已成為早產兒腦癱、智力障礙等神經系統(tǒng)后遺癥的主要原因之一，給家庭和社會帶來沉重負擔。目前，早產兒腦白質損傷的發(fā)病機制尚未完全明確，缺氧缺血是早產兒PWMD發(fā)生的兩個主要病因之一，而腦室周圍血管發(fā)育不完善是早產兒發(fā)生PWMD的重要解剖因素，目前針對早產兒PWMD)尚無有效的干預措施。所以尋找治療或預

2、防早產兒腦白質損傷的方法、改善早產兒生存質量已是目前迫切需要解決的問題之一。重組人促紅細胞生成素(recombinant humanerythropoietin，rh-EPO)多年來廣泛用于早產兒貧血的治療且取得較好的效果，隨著深入的研究發(fā)現(xiàn)EPO不僅具有造血功能，而且具有良好的神經保護作用。研究表明外周靜脈或腹腔內注射rh-EPO能通過血腦屏障直接在腦內發(fā)揮神經保護作用。目前國內外對rh-EPO與腦損傷的關系及機制研究主要集中于rh-

3、EPO對腦卒中及腦外傷等的神經保護作用，與早產兒PWMD的關系的研究仍少，尤其是其中的機制目前不明確。因此，本研究通過建立缺氧缺血性PWMD新生鼠模型，并給缺氧缺血后的新生鼠腹腔內注射一定劑量的rh-EPO，觀察rh-EPO對缺氧缺血的PWMD新生大鼠腦保護功能，并探討可能機制。該研究將為臨床治療早產兒PWMD提供一定的實驗信息及依據，為今后進一步研究早產兒PWMD的防治提供新的思路和途徑。
　　方法：本實驗采用生后3日齡的新生大

4、鼠，除假手術（Sham）組外，其余各組大鼠乙醚麻醉后取頸部正中切口，游離右側頸總動脈并結扎，術畢放回原飼養(yǎng)環(huán)境中恢復2～3小時后置于恒溫密閉容器中，以2L·min-1的速度輸入6％O2、94％N2混合氣體，持續(xù)4小時。Sham組大鼠手術僅游離右側頸總動脈但不結扎，不進行缺氧通氣。藥物干預組(HI-EPO)大鼠于缺氧后1小時內給予腹腔注射(5U/g)的rh-EPO。缺氧缺血(hypoxia-ischemia，HI)組和Sham組大鼠給予腹

5、腔注射相同劑量的無菌生理鹽水。第一部分:整個實驗過程中觀察大鼠的生長發(fā)育狀況，術后11天(P14)天斷頭取腦行HE染色觀察腦組織病理改變，生后(postnatal day，P)30天動物行為檢測（懸吊實驗、曠場實驗、拒俘反應實驗、圓筒實驗）和P90天學習記憶檢測（三臂迷宮實驗）。每小組完成實驗保證6只。第二部分:分別于術后2天(P5)、術后5天(P7)、術后7天(P10)和術后11天(P14)斷頭取腦，一部分標本用于免疫組化檢測EPO受

6、體(Eythropoietinreceptor，EPOR)和攜氧蛋白神經珠蛋白(Neuroglobin，Ngb)，一部分標本用于Western Blotting方法檢測EPOR蛋白，另一部分用于Real-time PCR方法檢測Ngb。每小組完成實驗保證6只。第三部分:分別于術后2天(P5)、術后5天(P7)、術后7天(P10)和術后11天(P14)斷頭取腦，一部分標本用于免疫組化檢測血管生成細胞內皮祖細胞(Endothelial pr

7、ogenitor cells，EPCs)，一部分標本用于Western Blotting法檢測EPCs，另一部分用Real-time PCR方法檢測血管內皮生長因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)、血管生成素-1(Angiopoietin-1，Ang-1)、新生微動脈標志EphrinB2和微靜脈標志EphB4。每小組完成實驗保證6只。
　　結果：⑴Sham組幼鼠死亡率為2.50％;

8、HI組幼鼠死亡率為16.12％; HI-EPO組幼鼠死亡率為8.23％;三組間死亡率差異存在統(tǒng)計學意義(x2=8.32，P＜0.05)。術前，各組大鼠體重差別無統(tǒng)計學意義(F=0.448，P=0.647)，自術后2天(P5)起HI組大鼠體重增長幅度低于Sham組，兩組間差異存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05);HI-EPO組大鼠在手術后初期體重增長情況不良，從術后7天始體重增長加快，體重高于HI組但略低于Sham組，而且與Sham組和HI組間

9、體重差異均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。⑵Sham組鼠雙側腦室大小相同，細胞排列整齊，形態(tài)大小正常。HI組鼠右側腦室較對側明顯增大，腦室形狀不規(guī)則，腦室周圍組織疏松，細胞變性、水腫，部分可見內囊部位空腔形成;HI-EPO組鼠腦室周圍白質病變減輕。⑶懸吊實驗、曠場實驗、拒俘實驗及三臂迷宮評分結果均顯示三組間存在統(tǒng)計學差異，進一步兩兩分析，HI組評分明顯低于Sham組(P＜0.05)，HI-EPO組評分改善高于HI組(P＜0.05)，且與

10、Sham組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。圓筒實驗評分結果顯示HI組偏好右前足的頻率與Sham組間存在明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.01），HI-EPO組則有改善，但未恢復到正常，與前兩組間均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。⑷Sham組大鼠EPOR表達在一較低水平;大鼠缺氧缺血后腦內EPOR在術后2天(P5)即明顯增多，術后4天(P7)則逐漸開始下降，但一直到術后11天(P14)仍保持在一較高水平，術后各時間點與Sham組比較有統(tǒng)計學意義

11、（P＜0.05）;HI-EPO組大鼠EPOR在術后2天(P5)較HI組及Sham組均增高且達到一高峰，與HI組及Sham比較增高有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但很快開始下降，在術后4天(P7)就降至HI組水平，術后7天(P10)和術后11天(P14)進一步下降，與Sham組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與HI組比較存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。⑸Sham組大鼠Ngb隨著日齡的增大而略微增加;大鼠HI后腦內Ngb在術后2天(P5)即

12、開始增加，術后7天(P10)及11天(P14)未表現(xiàn)出進一步增多，術后各時間點與Sham組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;HI-EPO組大鼠Ngb在術后2天(P5)至術后7天(P10)較HI組增高，且兩組之間比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），術后11天(P14) Ngb則下降，與HI組比較無統(tǒng)計學意義，但與Sham組比較仍有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。⑹Sham組CD34+細胞隨著日齡的增加而增加;HI后CD34+細胞較相同日齡Sha

13、m組大鼠初始增多（P5和P7），且兩組間差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但術后7天起(P10)開始下降，并少于相同日齡Sham組大鼠，兩組間差異存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05);HI-EPO組大鼠CD34+細胞變化趨勢同缺氧缺血組，且較相同日齡缺氧缺血組鼠增多，各時間點兩組間差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），同時與Sham組間差異也存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。⑺Sham組大鼠VEGF、Ang-1表達隨著日齡的增加而增加;大鼠HI

14、后腦內VEGF水平在術后2天(P5)即開始增加，至術后7天(P10)達到高峰，然后下降，各時間點VEGF表達量均較Sham組增多;HI-EPO組大鼠術后2天(P5) VEGF、 Ang-1表達量即較缺氧缺血組大鼠開始增加，術后7天(P10)達高峰，術后11天(P14)又開始下降但仍高于缺血缺氧組，各個時間點與缺血缺氧組間差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。⑻Sham組大鼠EphrinB2及EphB4表達均隨著日齡的增加而增加，各時間點E

15、phrinB2/EphB4比例接近0.5;大鼠缺氧缺血后腦內EphrinB2及EphB4在術后2天(P5)未見增加，EphrinB2/EphB4為0.49，與Sham組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但自術后4天(P7) EphrinB2及EphB4迅速增加，與Sham組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），術后7天(P10)開始則下降，但EphrinB2表達較EphB4多，EphrinB2/EphB4為0.56; HI-EPO組

16、大鼠術后2天(P5) EphrinB2及EphB4表達較HI組大鼠明顯增加（P＜0.05），術后4天(P7)達高峰然后開始下降，但仍高于缺血缺氧組，且EphrinB2表達較EphB4多。
　　結論：①缺氧缺血后腦組織有內源性修復反應，表現(xiàn)為腦室周圍白質EPOR表達增加，攜氧蛋白Ngb呈現(xiàn)持續(xù)上升表達，并有血管新生反應。②Rh-EPO對PWMD起到了保護作用，rh-EPO干預缺氧缺血腦白質損傷鼠可以明顯減輕腦室周圍白質區(qū)域的損傷，可