BMSCs對早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷模型腦內(nèi)炎癥環(huán)境的影響.pdf

1、目的:
　　觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷模型大鼠腦內(nèi)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)水平及活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響，同時(shí)評估大鼠遠(yuǎn)期神經(jīng)行為功能。探討B(tài)MSCs修復(fù)早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.取EGFP(enhanced green fluorescent pro

2、tein，EGFP)轉(zhuǎn)基因大鼠的脛、股骨骨髓，采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)、純化BMSCs;熒光倒置顯微鏡下觀察干細(xì)胞形態(tài);流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型分子;CCK-8法繪制細(xì)胞生長曲線并與野生型BMSCs增殖情況相比較;分別向成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化鑒定EGFP-BMSCs;
　　2.將3日齡清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為三組:WMD模型組、BMSCs移植組和假手術(shù)組。WMD模型組和BMSCs移植組大鼠經(jīng)異氟烷麻醉后予雙線結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈并吸入

3、氧濃度為6％的氧氮混合氣體2h，制作早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷模型。假手術(shù)組大鼠麻醉后僅游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不做缺血缺氧處理。BMSCs移植組造模后經(jīng)左側(cè)腦室定位注射EGFP-BMSCs懸液2μl（含細(xì)胞2×105個(gè)），WMD模型組造模后經(jīng)左側(cè)腦室定位注射2μl PBS，假手術(shù)組不予顱內(nèi)注射;
　　3.干預(yù)7d后，采用HE染色法觀察腦組織病理改變、免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠腦中ED-1陽性細(xì)胞數(shù);干預(yù)7d、27d后，采用免疫熒光法檢測EGFP

4、-BMSCs在大鼠腦部的定植情況;在分別干預(yù)6h、12h、24 h、48 h、7d后，采用ELISA和RT-PCR檢測各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β含量及mRNA的表達(dá)水平;
　　4.隨訪觀察大鼠至術(shù)后27d后，稱量并記錄術(shù)前、術(shù)后24h、48h、7d、27d的實(shí)驗(yàn)動(dòng)的體重，并在術(shù)后27d進(jìn)行動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)檢測評估各組大鼠的神經(jīng)功能情況;
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布

5、計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP的BMSCs，以長梭形為主，融合后呈漩渦狀排列;生長曲線示EGFP-BMSCs增殖能力旺盛，與野生型BMSCs比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.023，P=0.982);細(xì)胞CD29、CD90、CD34、CD49d、CD45表達(dá)率分別為99.4％、96.4

6、％、0.171％、0.049％、0.038％;成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)后，分別予以油紅O、茜素紅、甲苯胺藍(lán)染色，結(jié)果均呈陽性;
　　2.干預(yù)7d后，HE染色結(jié)果顯示W(wǎng)MD模型組的大鼠腦白質(zhì)區(qū)見部分細(xì)胞變性、壞死;BMSCs移植組的大鼠腦白質(zhì)區(qū)未見明顯細(xì)胞水腫、變性和壞死;假手術(shù)組大鼠腦部未見明顯異常。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示W(wǎng)MD模型組的大鼠腦內(nèi)ED-1陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于BMSCs移植組，假手術(shù)組明顯少于BMSCs移植組和WMD模型

7、組（LSD檢驗(yàn)，P值均＜0.05）。免疫熒光觀察顯示EGFP-BMSCs存活并定植于腦組織，但在干預(yù)27d后，腦內(nèi)定植的細(xì)胞基本消失。干預(yù)6h、12h、24h、48h和7d后，WMD模型組的大鼠腦內(nèi)TNF-α、IL-1β蛋白水平均在24 h達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢，至7d時(shí)仍未降至正常水平;WMD模型組的大鼠在各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著高于BMSCs移植組，假手術(shù)組TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)水平最低，差異均有統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義(LSD檢驗(yàn)，P值均＜0.05)。干預(yù)24 h后，WMD模型組TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)水平高于BMSCs移植組，假手術(shù)組表達(dá)水平明顯低于BMSCs移植組和WMD模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD檢驗(yàn)，P值均＜0.05)。
　　3.BMSCs移植組大鼠遠(yuǎn)期神經(jīng)功能發(fā)育及動(dòng)物體重較WMD模型組大鼠有所改善（LSD檢驗(yàn)，P值均＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)成功獲得高純度、穩(wěn)定表達(dá)EGFP的BMSCs