課題一：維生素D受體及其基因多態(tài)性在再生障礙性貧血發(fā)病機制中的作用課題二：IL-35在獲得性再生障礙性貧血中的表達及其作用研究.pdf

1、本文分為以下兩個課題進行探討：
　　課題一 維生素D受體及其基因多態(tài)性在再生障礙性貧血發(fā)病機制中的作用
　　第一部分 維生素D受體在獲得性再生障礙性貧血免疫失耐受中的作用研究
　　目的:本研究旨在檢測1，25(OH)2D3和VDR在AA患者中的表達，同時評價1，25(OH)2D3對AA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的作用，探討其在AA發(fā)病機制中的

2、作用，為AA的免疫抑制治療提供新的思路。
　　方法:(1)通過ELISA方法檢測血漿中25(OH)D3的表達，并進一步分析25(OH)D3水平與AA患者各臨床參數(shù)之間的關系;(2)通過實時定量PCR的方法檢測PBMCs以及1，25(OH)2D3處理后的PBMCs中VDR mRNA的表達水平;(3)通過CCK-8的方法檢測1，25(OH)2D3對PBMCs增殖的影響;(4)將患者PBMCs用1，25(OH)2D3處理，未處理組作為對

3、照。48小時后，采用ELISA的方法檢測培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-10和TGF-β1的水平變化，實時定量PCR的方法檢測T細胞相關轉錄因子T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3mRNA的表達變化，同時采用流式細胞術的方法檢測1，25(OH)2D3處理的PBMCs內Th1（CD3+CD8-IFNγ+）、Th2(CD3+CD8-IL4+)、Tc1(CD3+CD8+IFNγ+)、Tc2(CD3+CD8+IL

4、4+)和Th17(CD3+CD8-IL17+)細胞的比例變化。
　　結果:(1)初治AA患者血漿25(OH)D3的水平與完全緩解患者、正常對照組無顯著差異;(2)AA患者血漿25(OH)D3的水平與血小板計數(shù)、自然殺傷T細胞(naturalkiller T cells，NKT)比例呈顯著正相關，與B細胞比例呈負相關;(3)初治AA患者PBMCs VDR mRNA表達水平顯著低于正常對照組;(4)體外刺激實驗顯示1,25(OH)2D

5、3抑制AA患者PBMCs的增殖;(5)外源性1,25(OH)2D3的加入明顯抑制AA患者PBMCs分泌TNF-α、IFN-γ和IL-17A，并促進TGF-β1的產生;(6)1，25(OH)2D3抑制Th1、Tc1和Th17細胞的極化，同時促進Th2和Tc2細胞的極化，實時定量PCR的結果進一步證實1，25(OH)2D3抑制AA患者PBMCs內T-bet、RORγtmRNA的表達，同時促進GATA3、Foxp3 mRNA的表達;(7)1，

6、25(OH)2D3處理后正常對照組PBMCs中VDR mRNA的表達水平明顯上調，AA患者卻無明顯變化。
　　結論:初治AA患者PBMCs中VDR表達水平明顯降低，低表達的VDR可能使維生素D-VDR通路信號傳導減弱，從而導致AA的“高免疫”狀態(tài)。適量的補充維生素D可通過增強信號傳導來部分糾正AA免疫失耐受，有望成為一種新的輔助性治療策略。
　　第二部分 維生素D受體基因多態(tài)性與獲得性再生障礙性貧血的相關性研究
　　目

7、的:本研究旨在探討VDR基因四個多態(tài)性位點(rs2228570、rs1544410、rs7975232和rs731236)與AA易感性的關系，并評價VDR基因多態(tài)性與AA嚴重程度、治療療效及晚期克隆演變等臨床特征的相關性。
　　方法:采集AA患者和正常對照的外周血并提取DNA，采用聚合酶鏈反應-連接酶檢測反應(PCR-LDR)的方法檢測197例AA患者和135例健康對照rs1544410(c.1024+283 G＞A)、rs797

8、5232(c.1025-49G＞T)和rs731236(c.1056T＞C)的基因型。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測rs2228570(c.2T＞C)的基因型。應用SPSS17.0軟件統(tǒng)計分析VDR基因多態(tài)性位點與AA易感性、疾病嚴重程度、治療療效、克隆演變及其他臨床特征的相關性。
　　結果:(1) VDR基因四個多態(tài)性位點的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。(2)VDR基因rs15

9、44410、rs7975232和rs731236三個位點之間存在顯著的遺傳連鎖不平衡。(3)在VDR基因的四個多態(tài)性位點中，AA患者rs1544410位點GG基因型和G等位基因頻率顯著高于正常對照組，而其他三個多態(tài)性位點與AA易感性無關。(4)進一步分析發(fā)現(xiàn)rs1544410和rs7975232位點與非重型AA的發(fā)病相關，而rs2228570位點與重型AA的發(fā)病相關。(5) AA患者rs2228570位點的基因型與治療療效相關:CC及C

10、T基因型患者預后好于TT基因型者。(6)AA患者rs2228570位點的基因型與晚期克隆演變亦密切相關:TT基因型攜帶者更易于轉化為骨髓增生異常綜合征/急性髓系白血病，而CT基因型患者更易進展為陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥。
　　結論:我們的研究結果表明，在中國人群中，VDR基因多態(tài)性與AA的易感性、疾病嚴重程度及預后密切相關。
　　課題二 IL-35在獲得性再生障礙性貧血中的表達及其作用研究
　　目的:本研究旨在檢測AA

11、患者血漿中IL-35的表達情況，并評估IL-35對T細胞免疫反應的作用，探討其在AA發(fā)病機制中的作用，為基于IL-35的靶向治療提供理論依據(jù)。
　　方法:(1)收集患者臨床資料;(2)通過ELISA方法檢測血漿中IL-35的表達，并進一步分析IL-35水平與AA患者各臨床參數(shù)之間的關系;(3)通過實時定量PCR的方法檢測外周血單個核細胞(PBMCs)中IL-35兩個亞基p35和EBI3 mRNA的表達水平;(4)通過Brdu摻入法

12、檢測IL-35對PBMCs增殖的影響;(5)將患者和正常對照PBMCs用IL-35處理，未處理組作為對照。48小時后，采用ELISA的方法檢測培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ、 IL-17A、IL-10和TGF-β1的水平變化，流式細胞術和細胞計數(shù)相結合的方法檢測CD4+/CD8+T細胞、Th1(CD3+CD8-IFNγ+)、Th2(CD3+CD8-IL4+)、Tc1(CD3+CD8+IFNγ+)、Tc2(CD3+CD8+IL4+)和T

13、h17(CD3+CD8-IL17+)細胞的比例和絕對數(shù)變化，同時采用實時定量PCR的方法檢測T細胞相關轉錄因子T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3 mRNA的表達變化。
　　結果:(1)通過ELISA檢測，我們發(fā)現(xiàn)初治AA患者血漿中IL-35的水平明顯低于完全緩解(CR)患者和正常對照組，而CR患者和正常對照組之間無顯著差異，進一步分析發(fā)現(xiàn)IL-35水平與疾病的嚴重程度密切相關。(2)在初治AA患者，血漿IL-35的水平

14、與血小板計數(shù)、中性粒細胞絕對值和網織紅細胞絕對值呈顯著正相關，與淋巴細胞比例呈負相關。(3)實時定量PCR的結果顯示，初治重型AA患者p35和EBI3 mRNA表達水平低于正常對照組，而初治非重型AA與正常對照組之間無顯著差異。(4)體外刺激實驗顯示IL-35能抑制AA患者PBMCs的增殖，進而行細胞計數(shù)和流式細胞術發(fā)現(xiàn)IL-35能抑制CD4+和CD8+T細胞的增殖。(5)外源性IL-35的加入明顯抑制AA患者PBMCs分泌TNF-α、

15、IFN-γ和IL-17A，同時促進TGF-β的產生。(6)IL-35抑制Th1、Tc1和Th17細胞的極化，同時促進Th2和Tc2細胞的極化，實時定量PCR的結果證實IL-35抑制AA患者PBMCs內T-bet和RORγtmRNA的表達，同時促進GATA3mRNA的表達，對Foxp3 mRNA的表達無明顯影響。
　　結論:初治AA患者體內IL-35的表達水平降低，且與疾病嚴重程度密切相關，IL-35低表達可能致使Tregs失能，進