GRP75通過影響線粒體功能激活ROS-JNK-IRS信號(hào)通路參與細(xì)胞胰島素敏感性的調(diào)節(jié).pdf

1、GRP75(Glucose-Regulated Protein75)蛋白屬于熱休克蛋白mtHsp70家族成員，主要定位于線粒體基質(zhì)中還有一部分GRP75蛋白位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)以及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的囊泡中。GRP75蛋白能夠協(xié)助約有20％線粒體內(nèi)的蛋白進(jìn)入到線粒體中，幫助進(jìn)入線粒體內(nèi)的未折疊蛋白折疊成正確的構(gòu)象，同時(shí)GRP75蛋白還能夠協(xié)助錯(cuò)誤蛋白折疊成形成正確的蛋白構(gòu)象以及損傷蛋白的降解。現(xiàn)階段對(duì)于GRP75蛋白的研究主要集中在GRP75蛋白與細(xì)

2、胞的抗應(yīng)激反應(yīng)上的功能研究，但是對(duì)于GRP75蛋白與代謝性疾病尤其是細(xì)胞胰島素抵抗之間的關(guān)系研究現(xiàn)在還是空白狀態(tài)。因而，研究GRP75蛋白是如何參與細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗的機(jī)制有著十分重要的意義。通過高脂喂養(yǎng)制造的胰島素抵抗的小鼠模型中我們發(fā)現(xiàn)在小鼠的肝臟和脂肪細(xì)胞中GRP75蛋白的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，通過這個(gè)結(jié)果可以初步看出GRP75蛋白與胰島素抵抗之間存在著一定的關(guān)系。在3T3-L1及C2C12細(xì)胞中構(gòu)建了GRP75KD(Knock Do

3、wn)的細(xì)胞模型之后對(duì)其進(jìn)行功能的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GRP75KD的細(xì)胞產(chǎn)生了胰島素抵抗的現(xiàn)象。這進(jìn)一步證實(shí)了GRP75蛋白與細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗之間存在著直接的關(guān)系。
　　目的:
　　1.通過對(duì)胰島素抵抗小鼠細(xì)胞模型中的肝臟和脂肪及骨骼肌組織進(jìn)行WB(Western Blot)檢測(cè)，檢測(cè)脂肪組織和肝臟組織中GRP75蛋白的表達(dá)量。
　　2.使用RNAi(RNA interference)技術(shù)，對(duì)3T3-L1和C2C12細(xì)胞系進(jìn)

4、行GRP75蛋白進(jìn)行穩(wěn)定敲低，構(gòu)建穩(wěn)定的GRP75KD細(xì)胞模型。
　　3.檢測(cè)GRP75KD細(xì)胞對(duì)胰島素刺激下的葡萄糖吸收水平。
　　4.對(duì)GRP75KD細(xì)胞進(jìn)行線粒體功能檢測(cè)，主要檢測(cè):線粒體ATP生成能力、膜電位水平、ROS(Reactive Oxygen Species)水平，確定GRP75蛋白是否影響線粒體的功能。
　　5.對(duì)GRP75KD細(xì)胞胰島素信號(hào)通路進(jìn)行檢測(cè)，主要檢測(cè)AKT蛋白的Ser437位點(diǎn)和Thr

5、308位點(diǎn)的磷酸化水平，以及IRS1(Insulin Receptor Substrate1)Ser302和Ser307位點(diǎn)磷酸化水平檢測(cè)，確定GRP75蛋白敲低之后對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響。
　　6.對(duì)GRP75KD細(xì)胞中JNK蛋白的磷酸化水平檢測(cè)，確定GRP75蛋白敲低之后能否提高JNK蛋白的磷酸化水平。
　　7.對(duì)GRP75KD細(xì)胞加入NAC(N-acetyl-L-Cysteine)后，檢測(cè)細(xì)胞的胰島素信號(hào)通路是否得到恢

6、復(fù)，JNK蛋白磷酸化水平是否降低。
　　方法:
　　1.使用life technology公司的RNAi功能模塊設(shè)計(jì)了一條shRNA，通過查找文獻(xiàn)確定另外一條shRNA。使用兩條shRNA對(duì)3T3-L1和C2C12兩株細(xì)胞進(jìn)行RNAi。使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選獲得多個(gè)GRP75成功敲低的細(xì)胞克隆。
　　2.將GRP75KD細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋度達(dá)到80％之后，檢測(cè)胰島素刺激下的葡萄糖吸收水平在對(duì)照組及GRP75KD細(xì)胞之間的差異

7、。
　　3.將GRP75KD細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋度達(dá)到80％時(shí)進(jìn)行線粒體功能的檢測(cè)，分析GRP75敲低之后線粒體功能與正常對(duì)照之間的差異性。
　　1)應(yīng)用TMRM熒光染料檢測(cè)GRP75KD細(xì)胞的膜電位水平。
　　2)應(yīng)用ATP檢測(cè)試劑盒分析GRP75KD細(xì)胞內(nèi)以及線粒體內(nèi)的ATP生成能力
　　3)應(yīng)用ROS檢測(cè)試劑盒GRP75KD細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平
　　4)應(yīng)用DCFH-DA試劑盒檢測(cè)GRP75KD細(xì)胞內(nèi)整體

8、ROS水平。
　　4.對(duì)GRP75KD細(xì)胞中的胰島素信號(hào)通路蛋白進(jìn)行檢測(cè)，主要檢測(cè)胰島素信號(hào)通路中的AKT蛋白Ser437位點(diǎn)和Thr308位點(diǎn)的磷酸化水平以及IRS1蛋白Ser302和Ser307位點(diǎn)磷酸化水平檢測(cè)。
　　5.對(duì)GRP75蛋白敲低后的細(xì)胞的JNK蛋白磷酸化水平的檢測(cè)，通過WB技術(shù)檢測(cè)確定在GRP75KD細(xì)胞與正常對(duì)照細(xì)胞之間是否存在差異。
　　6.通過在GRP75KD細(xì)胞中加入NAC(N-乙酰半胱氨酸

9、)后，檢測(cè)JNK蛋白的磷酸化水平，AKT蛋白以及IRS1蛋白相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化水平是否發(fā)生變化。
　　結(jié)果和結(jié)論:
　　1.高脂喂養(yǎng)的胰島素抵抗小鼠的肝臟和白色脂肪組織中，GRP75蛋白在肝臟組織和肌肉組織中表達(dá)量具有顯著性的降低。同時(shí)IRS1蛋白Ser302位點(diǎn)磷酸化水平降低。
　　2.GRP75KD的3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞，胰島素刺激下的葡萄糖吸收在 GRP75KD的細(xì)胞中較正常細(xì)胞有顯著性的降低。

10、　　3.GRP75KD的3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)整體的ROS以及線粒體內(nèi)的ROS水平較對(duì)照細(xì)胞有顯著性的差異。
　　4.GRP75KD的3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞，線粒體的膜電位水平、ATP生成能力均有顯著性的下降。
　　5.GRP75KD的3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中，JNK(c-Jun N-terminal Kinase)蛋白的磷酸化水平增加，說明JNK蛋白在GRP75蛋白敲低之后JNK蛋白被

11、活化。
　　6.GRP75KD的3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中，AKT蛋白的Ser437位點(diǎn)和Thr308位點(diǎn)的磷酸化水平水平降低。
　　7.GRP75KD的3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中，IRS1蛋白的Ser302位點(diǎn)的磷酸化水平降低，Ser307位點(diǎn)的磷酸化水平增加。
　　8.通過對(duì)GRP75KD的3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中加入NAC之后，JNK蛋白的磷酸化水平降低。
　　9.通過對(duì)GRP75

12、KD的3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中加入NAC之后，AKT蛋白的Ser437位點(diǎn)和Thr308位點(diǎn)的磷酸化水平得到了一定程度的回復(fù)。
　　10.通過對(duì)GRP75KD的3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中加入NAC之后IRS1蛋白的Ser302位點(diǎn)的磷酸化水平得到一定程度的回復(fù)，Ser307位點(diǎn)的磷酸化水平降低。
　　11.通過對(duì)GRP75KD的3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中加入NAC之后，胰島素刺激下的葡萄糖吸收在對(duì)照