孤束核Phox2b神經(jīng)元化學敏感性的分子機制研究.pdf

1、中樞呼吸化學感受器反射通過動態(tài)調(diào)節(jié)呼吸運動和排出CO2維持腦和外周組織的酸堿平衡，因此是一種維持機體穩(wěn)態(tài)的重要反射。中樞呼吸化學感受器實際上是一個相互連接、相互作用的神經(jīng)環(huán)路，包括幾個特定腦干核團的神經(jīng)元，例如斜方體后核（retrotrapezoid nucleus，RTN）和孤束核（nucleus tractus solitaries，NTS）等，能感受腦組織細胞外液的PCO2或局部H+濃度變化而激活。中樞呼吸化學感受器，最少需要滿足

2、以下幾個特征：對生理范圍內(nèi)CO2/H+的變化具有內(nèi)在敏感性；在整體水平能感受CO2刺激并引起適應性通氣反應；與呼吸節(jié)律中樞有功能上的聯(lián)系，選擇性地激活、抑制或者損毀此細胞群能易化或者抑制呼吸化學感受器反射。雖然NTS神經(jīng)元基本上滿足上述標準，但有些問題尚需進一步明確，例如NTS化學敏感性神經(jīng)元是否有共同的分子標識？這些細胞上能感受CO2/H+的分子是什么？ Paired-like homeobox2b（Phox2b）是配對同源盒基因，編

3、碼一種同源盒轉錄因子，特異性地表達在呼吸反射傳入通路的神經(jīng)元上，例如，頸動脈體和主動脈體、巖狀神經(jīng)節(jié)、結狀神經(jīng)節(jié)、NTS和RTN等。而且， Phox2b基因突變是先天性中樞性低通氣綜合征（CCHS）的重要致病因素，大多數(shù)CCHS患者的Phox2b（>90％）存在聚丙氨酸的重復擴張（雜合性突變），可能導致中樞化學感受器的結構性缺陷及功能紊亂。研究表明，幾乎所有RTN的Phox2b神經(jīng)元都具有化學敏感性，激活后參與呼吸調(diào)控，提示Phox2b

4、可能是中樞化學感受器的一種重要的分子標識，但是NTS的Phox2b神經(jīng)元是否具有化學敏感性及其離子機制尚待明確。本課題正是基于上述領域存在的科學問題而設計，具體內(nèi)容如下：
　　目的：本研究旨在應用電生理、單細胞RT-PCR和免疫組織化學技術，在Phox2b-EGFP-Jx101轉基因小鼠的NTS區(qū)，觀察Phox2b神經(jīng)元對CO2/H+的電生理反應；CO2/H+敏感性神經(jīng)元的生物化學表型的分析。
　　方法：⑴Phox2b-EG

5、FP-Jx101轉基因小鼠的鑒定：應用PCR技術進行基因型鑒定；免疫熒光技術測試綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）標記的神經(jīng)元是否為Phox2b免疫反應陽性。⑵在急性制備的小鼠腦片上，應用細胞貼附式和全細胞膜片鉗技術，觀察CO2/H+對Phox2b神經(jīng)元自發(fā)放電頻率、細胞膜電位和全細胞電流的影響。⑶應用單細胞RT-PCR技術對具有化學敏感性Phox2b神經(jīng)元進行生物化學表型分

6、析。
　　結果：①免疫熒光結果表明，100%EGFP表達的NTS神經(jīng)元為Phox2b免疫反應陽性。②在阻斷突觸傳遞條件下，Phox2b神經(jīng)元的一個亞群（43%）表現(xiàn)為對CO2/H+的敏感性反應，這些神經(jīng)元主要分布在NTS的中央亞核和背側亞核。③細胞貼附式膜片鉗記錄表明，降低灌流液pH值或高碳酸溶液均使Phox2b神經(jīng)元自發(fā)放電頻率增加；因酸化使放電頻率變化表現(xiàn)為持續(xù)性或瞬時性增加兩種模式。④全細胞電流鉗模式下，降低灌流液pH值使P

7、hox2b神經(jīng)元膜電位去極化，放電頻率增加；全細胞電壓鉗模式記錄到一種pH敏感性電流，反轉電位大約是-85mV，推測為一種背景鉀離子電流。⑤單細胞RT-PCR結果揭示，具有化學敏感性的Phox2b神經(jīng)元均表達2型囊泡谷氨酸轉運體（vesicle glutamate transporter2，VGlut2），90%表達4型G蛋白耦聯(lián)受體（G protein coupled receptor4，GPR4）。
　　結論：孤束核Phox2