乙?；汪燃谆堁廴舛嗵堑闹苽浼捌淇寡趸兔庖哒{(diào)節(jié)活性的研究.pdf

1、目的：研究乙?；堁廴舛嗵呛汪燃谆堁廴舛嗵堑淖罴阎苽涔に?。研究龍眼肉多糖、乙?；堁廴舛嗵呛汪燃谆堁廴舛嗵窃隗w外的抗氧化作用，并采用體內(nèi)、外試驗(yàn)法研究龍眼肉多糖乙酰化和羧甲基化衍生物的免疫活性，闡述龍眼肉多糖及其衍生物的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，為龍眼肉多糖的產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：1.采取水提醇沉法從龍眼肉中獲取龍眼肉粗多糖，蛋白酶解法脫去蛋白質(zhì)，H2O2氧化法脫去色素，透析法去除小分子物質(zhì)，并用苯酚-硫酸法測(cè)定龍

2、眼肉粗多糖中的糖含量。2. DEAE-52纖維素層析柱和Sephacryl S-300 HR層析柱對(duì)除雜后的龍眼肉多糖進(jìn)一步純化，獲取均一多糖組分LYP2。3.選取乙酸酐作為乙?；噭┲苽湟阴；堁廴舛嗵牵ˋc-LYP2），以Ac-LYP2的取代度（DS）為指標(biāo)，使用響應(yīng)面分析法優(yōu)化Ac-LYP2的制備工藝。4.在氫氧化鈉-一氯乙酸（MCA）體系下制備羧甲基化龍眼肉多糖（CM-LYP2），以CM-LYP2的DS為指標(biāo)，使用響應(yīng)面分析法優(yōu)

3、化CM-LYP2的制備工藝。5.測(cè)定Ac-LYP2和CM-LYP2的總還原能力，對(duì)羥基自由基（·OH）和超氧陰離子（O2·-）清除效果；考察Ac-LYP2和CM-LYP2在體外對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用以及H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用。6.利用環(huán)磷酰胺腹腔注射小鼠制備免疫抑制模型，研究Ac-LYP2和CM-LYP2對(duì)免疫抑制小鼠免疫系統(tǒng)的保護(hù)作用，在試驗(yàn)過(guò)程中采用脾臟指數(shù)（SI，Spleen Index）觀察Ac-LYP2和C

4、M-LYP2對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官的影響；通過(guò)建立小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)模型并根據(jù)耳腫脹程度來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的細(xì)胞免疫功能；通過(guò)檢測(cè)小鼠血清中的溶血素含量評(píng)價(jià)其體液免疫功能；通過(guò)檢測(cè)小鼠血清和脾臟中的溶菌酶含量來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的非特異性免疫功能。檢測(cè)血清INF-γ和IL-4含量評(píng)價(jià)Ac-LYP2和CM-LYP2對(duì)Th1/Th2免疫應(yīng)答模式的影響。7.研究Ac-LYP2和CM-LYP2的體外免疫調(diào)節(jié)活性，從脾臟增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬能力、NO和細(xì)胞因子分

5、泌功能等方面進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，綜合評(píng)價(jià)Ac-LYP2和CM-LYP2對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：1.水提醇沉法提取的龍眼肉多糖得率為7.22％，龍眼肉粗多糖中的糖含量達(dá)到67.85%；木瓜蛋白酶法測(cè)定的蛋白清除率為71.58%；從0.125 mol/L NaCl流分中得到均一多糖組分LYP2。2.龍眼肉多糖乙?；罴押铣晒に嚍椋阂宜狒篖YP2=10.2:1，反應(yīng)溫度42℃，反應(yīng)時(shí)間30 min。該反應(yīng)條件下合成的乙?；堁廴?/p>

6、多糖的DS達(dá)到0.443。3.對(duì)LYP2進(jìn)行羧甲基化修飾的最佳制備工藝為：MCA濃度1.2 mol/L，反應(yīng)溫度73℃，反應(yīng)時(shí)間3.2 h。根據(jù)該制備工藝得到的羧甲基化龍眼肉多糖的DS約為1.053。4. LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2均具有不同程度的清除自由基能力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力及對(duì)過(guò)氧化氫損傷細(xì)胞的保護(hù)能力。LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2清除羥基自由基的半數(shù)清除濃度（EC50）分別為5507.67μg/mL（

7、4.67×10-5 mol/L）、702.41μg/mL（5.45×10-6 mol/L）和519.39μg/mL（3.44×10-6 mol/L）；LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2清除超氧陰離子自由基的EC50分別為2219.05μg/mL（1.88×10-5 mol/L）、977.12μg/mL（7.57×10-6 mol/L）和489.70μg/mL（3.24×10-6 mol/L）；LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP

8、2抑制小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為917.99μg/mL（7.78×10-6 mol/L）、646.04μg/mL（5.01×10-6 mol/L）和544.21μg/mL（3.60×10-6 mol/L）；LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2抑制H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的IC50分別為620.82μg/mL（5.26×10-6 mol/L）、380.11μg/mL（2.95×10-6 mol/L）和262.7

9、6μg/mL（1.74×10-6 mol/L）；5.在20~160 mg/kg范圍內(nèi)，LYP2，Ac-LYP2和CM-LYP2均能在一定程度上提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)，顯著提高免疫抑制小鼠耳腫脹度、同時(shí)顯著升高半數(shù)溶血值（HC50）、血清中IL-4含量和溶菌酶含量，降低血清中IFN-γ含量，并且相同濃度下，Ac-LYP2和CM-LYP2表現(xiàn)出的免疫效應(yīng)更強(qiáng)。6.三個(gè)多糖組分協(xié)同脂多糖（LPS）促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篊M-LY

10、P2> LYP2> Ac-LYP2，而協(xié)同刀豆蛋白（Con A）促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篈c-LYP2> LYP2> CM-LYP2。LYP2、Ac-LYP2和CM-LYP2均能協(xié)同LPS顯著地增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，且表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。其活性強(qiáng)弱順序依次為：Ac-LYP2> CM-LYP2>LYP2。LYP2、Ac-LYP2和CM-LYP2可以促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO和細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-12p40。

11、
　　結(jié)論：1.乙酸酐法優(yōu)選的乙?；堁廴舛嗵呛铣晒に嚪€(wěn)定可行，是一種合成多糖乙酰化衍生物比較理想的方法。2.采用氫氧化鈉-MCA體系制備多糖羧甲基衍生物簡(jiǎn)單易行、穩(wěn)定可控，是一種比較理想的化學(xué)修飾方法。3.乙?；汪燃谆囊胗欣谔岣啐堁廴舛嗵堑目寡趸芰?，從質(zhì)量濃度角度考慮，Ac-LYP2和CM-LYP2的抗氧化能力弱于維生素C，若從物質(zhì)的量濃度考慮，維生素C的抗氧化能力不及Ac-LYP2和CM-LYP2。4. LYP2、A