紫草等中藥多糖免疫調(diào)節(jié)活性的研究.pdf

1、近年來，植物多糖已作為有生物活性的天然產(chǎn)物中的一個重要類型出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)植物多糖具有廣泛的藥理作用：具有免疫調(diào)節(jié)作用，激活巨噬細胞、T淋巴細胞、LAK細胞等多種免疫細胞，促進細胞因子生成，活化補體；抗腫瘤、抗感染、抗病毒、抗消化性潰瘍、抗氧化等，而且毒性相對較低，因此越來越受到研究人員的重視[1，2]。本課題選擇了臨床上用于治療感染性疾病的常用中草藥紫草、柴胡、魚腥草、杜仲，研究這4種傳統(tǒng)中藥多糖提取物的抗炎及免疫調(diào)節(jié)活性。
　　

2、本課題主要是通過檢測紫草、柴胡、魚腥草、杜仲多糖對正常健康人外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)以及LPS活化PBMC表達炎癥相關(guān)細胞因子的影響，探討其抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性的分子機制。我們利用real-time RT-PCR法檢測TNF-α、IL-10、IFNγ、IL-4、IL-18及相關(guān)細胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平，通過Western-blot檢測PBMC中ERK磷酸化水平。初步結(jié)果

3、顯示，紫草等中藥多糖可調(diào)節(jié)TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-4、IL-18及相關(guān)細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，具有抗炎及調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答的功能；且紫草多糖可能是通過抑制PBMC的MAPK信號通路進而抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)細胞因子TNF-α等高表達。為紫草等中藥多糖作為抗炎、免疫調(diào)節(jié)藥物的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
　　一、中藥多糖誘導(dǎo)TNF-α及IL-18等相關(guān)細胞因子的表達
　　本實驗主要觀察紫草、柴胡、魚腥草、杜仲多糖對正

4、常健康人PBMC表達TNF-α、IL-10、IFNγ、IL-4、IL-18、IL-18BP、IL-18Rα、IL-18Rβ的影響。首先用紫草、柴胡、魚腥草、杜仲多糖分別處理PBMC，4h、24h后利用real-timeRT-PCR檢測細胞因子轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與未處理組相比，紫草、柴胡、魚腥草、杜仲多糖在處理PBMC早期(4h)，均可增強PBMC TNF-α、IL-10、IL-18的轉(zhuǎn)錄，而抑制IL-18BP的轉(zhuǎn)錄；而在處理晚期(24

5、h)，對所測的細胞因子表達無明顯影響。提示多糖對細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響主要在處理早期。
　　我們進一步檢測了紫草等中藥多糖處理PBMC后，不同時間點(1h、2h、6h、12h、24h)上述細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，紫草多糖增強TNF-α的轉(zhuǎn)錄，2h時達高峰，是未處理組的4.1倍；柴胡多糖增強TNF-α的表達，1h時達高峰，是未處理組的6.6倍；魚腥草、杜仲多糖均增強TNF-α的轉(zhuǎn)錄，6h時達高峰，分別是未處理組的7.8倍、2.

6、1倍。紫草、柴胡、魚腥草多糖均增強IL-10的表達，6h時達高峰，分別是未處理組的5.3倍、2.5倍、3.3倍。紫草、柴胡、魚腥草多糖均可增強IFNγ的表達，6h時達高峰，分別是未處理組的4.6倍、5.7倍、5.2倍。柴胡多糖在處理PBMC早期，可增強IL-4的表達，2h時達高峰，是未處理組的3.9倍；紫草、魚腥草多糖均增強IL-4的轉(zhuǎn)錄，6h時達高峰，分別是未處理組的2.8倍、3.5倍。柴胡、魚腥草多糖處理PBMC，可增強IL-18的

7、表達，2 h時達高峰，分別是未處理組的2.1倍、3.3倍；而抑制IL-18BP的表達，于12h時作用最強，分別是未處理組的23.5％、31.9％。紫草多糖可增強IL-18Rα、IL-18Rβ的轉(zhuǎn)錄，6h時達高峰，分別是未處理組的1.8倍、2.6倍。研究證明紫草、柴胡、魚腥草、杜仲多糖可調(diào)節(jié)TNF-α、IL-18等相關(guān)細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，具有抗炎及調(diào)節(jié)天然免疫活性的功能，且對哺乳動物細胞無明顯的毒性作用，為其作為抗炎、免疫調(diào)節(jié)藥物及其抗炎

8、機制研究奠定基礎(chǔ)。
　　二、紫草多糖對LPS活化的PBMC表達炎癥相關(guān)細胞因子的影響
　　為了研究紫草多糖的抗炎活性，我們檢測了紫草多糖對LPS活化的PBMC表達TNF-α、IL-10、IL-18、IL-18BP、IL-18Rα、IL-18Rβ的影響。結(jié)果顯示，LPS處理PBMC早期(4h)可增強TNF-α、IL-18的轉(zhuǎn)錄，而用紫草多糖處理可抑制LPS活化的PBMC TNF-α、IL-18的表達(抑制率達15～50％)。<

9、br>　　LPS可激活MAPK通路誘導(dǎo)致炎因子的轉(zhuǎn)錄，為了研究紫草多糖抑制LPS誘導(dǎo)的致炎因子TNF-α轉(zhuǎn)錄的機制，我們用紫草多糖分別處理LPS活化的4個正常健康人PBMC，利用Western-blot檢測MAPK通路中關(guān)鍵蛋白ERK磷酸化水平。結(jié)果顯示，LPS可誘導(dǎo)PBMC的ERK磷酸化，紫草多糖處理可抑制LPS誘導(dǎo)的ERK磷酸化，抑制率達39％～73％。提示紫草多糖可能是通過抑制PBMC的MAPK信號通路進而抑制LPS誘導(dǎo)的致炎因子

10、TNF-α等高表達。
　　三、Staphylococcus carnosus作為新型HBV DNA疫苗載體的初步研究
　　在完成上述工作的同時，我們還進行了Staphylococcus carnosus作為新型HBV DNA疫苗載體的研究。構(gòu)建pkmcp/HBsAg真核表達質(zhì)粒，研究了pkmcpl/HBsAg誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答。ELISA檢測免疫小鼠抗-HBs抗體滴度的結(jié)果顯示，在初次免疫的第4周即可檢測到抗-HB