NLRP3炎癥體參與A549細(xì)胞分泌Il-1β、Il-18的作用及機(jī)制研究.pdf

1、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distresssyndrome，ALI/ARDS)是臨床常見的危重癥，盡管近年來治療手段有所發(fā)展，然而病死率仍較高。有關(guān)ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，但是目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)失衡在其發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，而有關(guān)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生釋放機(jī)制目前仍未完全闡明。白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞

2、介素18(interleukin-18，IL-18)是ALI/ARDS發(fā)展過程中較為重要的炎性介質(zhì)，目前研究表明，IL-1β、IL-18的產(chǎn)生受NLRP3炎癥體通路的調(diào)控。
　　NLRP3炎癥體是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多蛋白復(fù)合體，其組件包括核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3，NLRP3)、凋亡相關(guān)微粒蛋白(apo

3、ptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase1)共同組成。其可以識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecularpattern，PAMPs)，比如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS

4、)，或者損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMPs)，比如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，從而由靜止形式轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨问?，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β和IL-18釋放。
　　研究表明肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在NLRP3炎癥體通路，且其活化以后參與了ALI的發(fā)生發(fā)展，然而在肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelialcells

5、.AEC)是否也存在NLRP3炎癥體通路，該通路能否在LPS的刺激下活化并釋放炎性介質(zhì)IL-1β、IL-18目前尚未見明確研究報(bào)道。鑒于此，本課題以肺泡上皮來源的A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察其是否存在NLRP3炎癥體通路，并探討LPS或LPS聯(lián)合ATP刺激后NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18分泌情況，并明確A549細(xì)胞IL-1β、IL-18的分泌是否與NLRP3炎癥體有關(guān)。
　　目的:
　　探討肺上

6、皮來源A549細(xì)胞在LPS或LPS聯(lián)合ATP刺激后NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18分泌情況，初步了解NLRP3炎癥體通路在人肺上皮來源A549細(xì)胞中的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1.A549細(xì)胞內(nèi)NLRP3/ASC/caspase-1炎癥體mRNA及蛋白表達(dá)
　　以人肺上皮來源A549細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用RT-PCR、Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞是否存在NLRP3/ASC/c

7、aspase-1 mRNA及蛋白水平表達(dá)。
　　2.LPS對(duì)A549細(xì)胞NLRP3炎癥體通路相關(guān)mRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　予以不同濃度LPS（0，1，5，10，50，100μg/ml）刺激A549細(xì)胞相同時(shí)間及相同濃度LPS(10μg/ml)刺激不同時(shí)間(0h，3h，6h，12h，24h，48h)，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞NLRP3、caspase-1 mRNA的表達(dá)情況，Western blot探討L

8、PS是否能激活NLRP3炎癥體及其激活的最佳時(shí)間和濃度。
　　3.LPS聯(lián)合ATP處理對(duì)A549細(xì)胞NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)的影響
　　根據(jù)LPS刺激A549細(xì)胞后，NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)的時(shí)效與量效關(guān)系，選定10μg/ml LPS先預(yù)激細(xì)胞6h，再給以0mmol/L，0.5mmol/L，1mmol/L，2mmol/L，4mmol/LATP刺激1h，Western blot檢測(cè)LPS聯(lián)合ATP刺激是否能激活A(yù)549

9、細(xì)胞的NLRP3炎癥體通路。
　　4.不同刺激條件對(duì)A549細(xì)胞caspase-1活性及IL-1β、IL-18分泌的影響
　　將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、LPS單獨(dú)刺激組、ATP單獨(dú)刺激組、LPS聯(lián)合ATP刺激組，caspase-1活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-1活性，Western blot、ELISA技術(shù)分別檢測(cè)NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)及IL-1β、IL-18分泌情況。
　　5.NLRP3-siRNA干擾對(duì)LPS聯(lián)合

10、ATP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18的影響
　　采用NLRP3-siRNA下調(diào)NLRP3基因表達(dá)后，ELISA檢測(cè)LPS聯(lián)合ATP刺激A549細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18濃度變化。
　　結(jié)果:
　　1.A549細(xì)胞中存在NLRP3炎癥體各組件NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　2.與對(duì)照組相比，LPS單獨(dú)處理組可誘導(dǎo)A549細(xì)胞NLRP3、caspa

11、se-1mRNA及NLRP3、caspase-1、pro-IL-1β蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)，且表達(dá)量具有LPS時(shí)間和劑量依賴性，但是不能誘導(dǎo)活化形式的caspase-1p20蛋白表達(dá)及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的分泌（P＞0.05），
　　3.與對(duì)照組相比，ATP單獨(dú)刺激組不引起NLRP3、caspase-1 p45、caspase-1p20、pro-IL-β蛋白表達(dá)變化及IL-1β、IL-18分泌(P＞0.05)。

12、r>　　4.與LPS單獨(dú)刺激組相比，LPS聯(lián)合ATP刺激組檢測(cè)到活化形式的caspase-1 p20蛋白表達(dá)及IL-1β、IL-18的分泌（P＜0.05）。與對(duì)照組、LPS單獨(dú)刺激組和ATP單獨(dú)刺激組相比，LPS聯(lián)合ATP刺激組A549細(xì)胞caspase-1活性最強(qiáng)(P＜0.05)，對(duì)照組、LPS單獨(dú)刺激組和ATP單獨(dú)刺激組之間caspase-1活性無差異(P＞0.05)。
　　5.采用NLRP3-siRNA下調(diào)NLRP3基因表達(dá)

13、，可抑制LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞IL-1β、IL-18的分泌。
　　結(jié)論:
　　1.在肺上皮來源A549細(xì)胞中存在NLRP3炎癥體通路。
　　2.LPS可上調(diào)NLRP3炎癥體通路NLRP3mRNA、caspase-1mRNA及NLRP3、caspase-1、pro-IL-1β蛋白表達(dá)，但是不能活化NLRP3炎癥體，單獨(dú)的ATP既不能上調(diào)NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)，也不能活化NLRP3炎癥體。
　　3.

14、LPS聯(lián)合ATP刺激A549細(xì)胞可活化NLRP3炎癥體，表現(xiàn)為活性形式的caspase-1p20蛋白的表達(dá)、活性形式的IL-1β、IL-18分泌、caspase-1活性增強(qiáng)，提示A549細(xì)胞中NLRP3炎癥體的完全激活可能需要兩種不同刺激因素的參與。
　　3.LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)A549細(xì)胞分泌的炎性因子IL-1β、IL-18在下調(diào)NLRP3基因以后顯著減少，初步提示IL-1β、IL-18的分泌可能是受NLRP3炎癥體途徑調(diào)控。<