單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在硫胺素缺乏阿爾茨海默病模型小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元中的表達(dá)改變.pdf

1、背景：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以高度磷酸化的tau蛋白纏結(jié)出現(xiàn)，Aβ蛋白的沉積以及神經(jīng)元丟失為病理學(xué)特征的慢性神經(jīng)退行性疾病[1,4,5]。對于其發(fā)病機(jī)制的研究，近幾年來研究人員逐漸在關(guān)注中樞神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝與失衡。代謝異常或障礙將會影響神經(jīng)突觸的形成以及神經(jīng)元的功能，因此可能與 AD的發(fā)病相關(guān)。硫胺素缺乏（Thiamine Deficiency,TD）時，可造成哺乳動物腦中特定區(qū)

2、域，如丘腦、中腦、腦干、及小腦等處神經(jīng)元的特異性死亡，而此特征則是許多與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，如AD、PD（Parkinson’sdisease,PD）等的共同特征。TD所造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的表現(xiàn)被稱為腦型維生素B1缺乏癥，即韋尼克-科爾薩科夫綜合征（Wernicke Korsakoff’s syndrome,WKS）[7,8],與老年退行性疾病的病理特征和臨床表現(xiàn)相同。同時TD可使細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑以及三羧酸循環(huán)出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致A

3、TP產(chǎn)生受阻，因此產(chǎn)生細(xì)胞能量代謝障礙[6,7]，從而影響神經(jīng)元對乳酸的利用。近來證據(jù)顯示，乳酸不僅是神經(jīng)元重要的能量代謝底物[11]，還是促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶形成的關(guān)鍵因素[9,10]。而單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（monocarboxylate transporters,MCTs）作為一類轉(zhuǎn)運(yùn)乳酸等單羧酸物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12]，已有研究證實(shí)，其家族中的MCT2與MCT4存在于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，并參與乳酸在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[13-17]。據(jù)此，

4、我們推測MCT2與MCT4介導(dǎo)的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)不僅是腦內(nèi)能量代謝的重要組成部分，更與AD的發(fā)病和記憶力減退密切相關(guān)。因此，對MCT2和MCT4在TD化AD模型小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞中的改變進(jìn)行研究，有助于為AD疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。
　　目的：
　　通過探討MCT2，MCT4在硫胺素缺乏的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元中的表達(dá)改變，以及其與模型小鼠AD疾病表現(xiàn)的聯(lián)系，為探索AD疾病發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

5、方法：
　　1.選取2月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型雄性小鼠和同月齡相同基因背景C57BL/6J野生型雌性小鼠（Wild Type，WT）交配繁育F1代，組織提取DNA進(jìn)行基因型鑒定。
　　2.小鼠腦部圖譜的定位下進(jìn)行小鼠右側(cè)海馬齒狀回的維生素B1拮抗劑注射，制作動物硫胺素缺乏（Thiamine Deficiency,TD）模型，同時使用0.9％的生理鹽水右側(cè)海馬齒狀回注射作為control組。
　　3.

6、在TD處理之前和TD處理后3d和7d時分別使用主動規(guī)避儀和被動規(guī)避儀進(jìn)行行為學(xué)檢測。
　　4.TD處理后3d和7d取出腦組織使用免疫組化，免疫熒光，Western Blot和RT-PCR方法檢查小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞中MCT2和MCT4的位置和表達(dá)變化，以及DNA拷貝數(shù)量的改變
　　結(jié)果：
　　1.APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定的目的基因大小為350 bp，選取具有目的基因的小鼠作為阿爾茨海默病模型小鼠。
　　2.

7、行為學(xué)檢測結(jié)果顯示：在被動規(guī)避實(shí)驗(yàn)中，APP/PS1小鼠TD處理前較TD處理后STL時間由20.5±0.9 s增加為42.4±0.3 s(P<0.05)，WT小鼠TD處理前較TD處理后STL時間由19.9±0.9 s增加為36.5±0.9 s(P<0.05)；在主動規(guī)避實(shí)驗(yàn)中，APP/PS1小鼠TD處理前較TD處理后條件反應(yīng)由45±0.2次減少為40±0.2次(P<0.05)，非條件反應(yīng)由41±0.3次增加至43±0.2次(P<0.05

8、)，無反應(yīng)由2.5±0.2次增加至5.3±0.7次(P<0.05)，WT小鼠TD處理前較TD處理后條件反應(yīng)由49±0.7次減少為41±0.4次(P<0.05)，非條件反應(yīng)由43±0.2次增加至49±0.1次(P<0.05)，無反應(yīng)由2.2±0.4次增加至4.6±0.2次(P<0.05)。
　　3.Western Blot結(jié)果顯示TD處理后，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠和WT小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的MCT2和MCT4蛋白表達(dá)量均較co

9、ntrol組明顯增加，其中APP/PS1小鼠MCT2表達(dá)量TD組（2.32±0.06）較control組（0.37±0.04）增高(P<0.05)，MCT4表達(dá)量TD組（4.75±0.06）較control組（1.85±0.02）增高(P<0.05)，WT小鼠MCT2表達(dá)量TD組（3.01±0.04）較control組（1.12±0.03）增高(P<0.05)，MCT4表達(dá)量TD組（9.82±0.06）較control組（1.97±0.

10、04）增高(P<0.05)。
　　4.RT-PCR結(jié)果顯示W(wǎng)T小鼠在TD處理后隨時間延長而MCT2和MCT4表達(dá)量增加明顯，即TD處理后MCT2拷貝量7 d（4.27±0.02）較3d（2.61±0.05）增高(P<0.05)，MCT4拷貝量7 d（11.22±0.03）較3 d（7.65±0.04）增高(P<0.05)，而APP/PS1小鼠則隨時間延長表達(dá)量呈逐漸減少的趨勢，即TD處理后MCT2拷貝量7 d（1.45±0.06）