肌萎縮側索硬化-額顳葉癡呆患者腦脊液培養(yǎng)U251細胞誘導隧道納米管及外泌體形成的機制研究.pdf

1、背景：
　　肌萎縮側索硬化（amyotrophiclateralsclerosis,ALS)是以選擇性、進行性上、下運動神經元損害為顯著特征的慢性神經系統(tǒng)變性疾病。額顳葉癡呆(frontotemporaldementia，FTD)是中老年人緩慢出現的以人格改變、言語障礙以及行為異常為主要臨床表現的一種癡呆類型。有統(tǒng)計顯示，既符合ALS又符合FTD的占10％。ALS及FTD均為以選擇性、進行性神經元死亡為主要特征的神經系統(tǒng)變性疾病，

2、目前二者的病因及發(fā)病機制尚不明確。肌萎縮側索硬化及額顳葉癡呆患者的病理學研究顯示兩者具有重疊性，即神經系統(tǒng)殘存的神經元及膠質細胞內存在TDP-43免疫反應陽性包涵體，表明兩者雖然具有不同的臨床表現，但可能具有相似的潛在發(fā)病機制。數年前，朊蛋白樣播散理論的發(fā)現為神經系統(tǒng)退行性疾病的研究帶來了巨大突破，異常折疊的朊蛋白可誘導正常的朊蛋白異常折疊聚集形成包涵體，并通過神經元及膠質細胞轉運、擴散至整個中樞神經系統(tǒng)，引起神經系統(tǒng)的損害并出現相應的

3、臨床癥狀。Tau,a-synuclein以及huntingtin陽性包涵體已被證明可在細胞間播散，這為TDP-43免疫陽性包涵體在神經元及膠質細胞間類似朊蛋白樣播散提供了依據。最近有研究表明從ALS及FTD患者腦組織中提取的不溶性的TDP-43蛋白可作為種子在細胞間播散。但是，目前沒有明確證據表明TDP-43免疫陽性包涵體可以在人與人之間或者實驗動物之間播散并導致疾?。淮送?，TDP-43免疫反應陽性包涵體在中樞神經系統(tǒng)中的播散方式仍不明

4、。隧道納米管(tunnelingnanotubes,TNTs)是哺乳動物細胞間一種新型的通訊鏈接方式，是由細胞膜及以F-actin為主的細胞骨架成分組成，一直處于形成和斷裂的持續(xù)變化狀態(tài)之中。最新的研究發(fā)現蛋白聚集體、病毒及朊蛋白也可通過TNTs在細胞間轉運。外泌體(exosomes)——細胞分泌的納米級膜性小泡，可在細胞間起到信息交流作用，參與細胞遷移、血管形成、細胞增殖、免疫反應、組蛋白修飾等病理生理過程的信息交換及細胞間通訊。因此

5、，我們推測TNTs及exosomes可能是TDP-43免疫陽性包涵體在ALS-FTD患者中樞神經系統(tǒng)中播散的途徑。
　　目的：
　　本實驗通過建立腦脊液培養(yǎng)細胞模型，研究ALS-FTD患者腦脊液誘導人星形膠質細胞U251TNTs及exosome形成的機制研究,初步探討TDP-43免疫反應陽性包涵體在中樞神經系統(tǒng)播散的途徑。
　　方法：
　　1、本研究收集病例組肌萎縮側索硬化-額顳葉癡呆患者8例，以及正常對照組15

6、例，通過腰椎穿刺術收集腦脊液標本。
　　2、建立腦脊液培養(yǎng)細胞模型，分別培養(yǎng)神經膠質細胞U2510，1，3，5，7，10，14，18，21，28d，通過免疫熒光顯微鏡觀察TDP-43免疫陽性包涵體、TNTs、exosomes的形成,并觀察F-actin、exosomes與TDP-43是否存在亞細胞共定位,記錄表達TNTs結構的U251細胞含量百分比。
　　3、統(tǒng)計分析：應用SPSS21.0軟件對本實驗所有數據進行分析。各組計

7、量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析檢驗，組內比較采用Bonferroni法，檢驗水準α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、與對照組相比，在ALS-FTD患者腦脊液（ALS-FTD-CSF）培養(yǎng)條件下，U251細胞中形成了TDP-43免疫陽性包涵體；TDP-43免疫陽性包涵體與TNTs標記物F-actin及exosomes標記物flotillin-1存在亞細胞共定位。
　　

8、2、與對照組相比，在ALS-FTD-CSF培養(yǎng)條件下，TNTs表達水平上調（P<0.05），表達TNTs的U251細胞含量百分比在第3天開始增加(117%)，在第5天達到高峰（128%），在第10d開始逐漸下降（116%），較對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：
　　1、ALS-FTD患者腦脊液培養(yǎng)U251可誘導TDP-43免疫陽性包涵體的形成。
　　2、ALS-FTD患者腦脊液培養(yǎng)人星形膠質細胞誘導T