髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A在實(shí)驗(yàn)性小鼠肝纖維化發(fā)生和逆轉(zhuǎn)過(guò)程中作用的研究.pdf

1、肝纖維化是多種慢性肝臟疾病向肝硬化發(fā)展過(guò)程中的必經(jīng)階段，是各種病因?qū)е卵装Y、壞死等組織損傷的修復(fù)反應(yīng)。若肝纖維化進(jìn)程得不到阻抑或逆轉(zhuǎn)則可能進(jìn)展為失代償期肝硬化，并出現(xiàn)各種終末期肝病并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和預(yù)后。但目前肝纖維化的治療效果不甚理想，尚乏有效治療手段。因此，對(duì)肝纖維化的深入研究極具必要性和重要意義。
　　肝纖維化的病理特征是細(xì)胞外間質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的過(guò)量沉積。肝臟內(nèi)多種細(xì)胞以

2、不同形式參與肝纖維化形成，其中肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSCs）的活化、增殖，產(chǎn)生大量ECM是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，主要通過(guò)吞噬作用清除病原體和異物，并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。此外，巨噬細(xì)胞還具有免疫調(diào)節(jié)和抗原遞呈功能。既往研究證實(shí)在肝纖維化發(fā)生階段持續(xù)的損傷刺激可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向肝臟募集并分泌大量具有促炎、促纖維化功能的細(xì)胞因子，通過(guò)促進(jìn)HSCs活化和增殖參與肝纖維化進(jìn)程，在

3、該過(guò)程中通過(guò)減少巨噬細(xì)胞向肝臟募集或抑制其功能均能減輕肝纖維化程度。然而，在肝纖維化恢復(fù)階段巨噬細(xì)胞發(fā)揮截然相反的作用，主要通過(guò)分泌一系列基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）加速ECM降解，在此過(guò)程中減少巨噬細(xì)胞募集可顯著阻止肝纖維化恢復(fù)。因此，深入研究巨噬細(xì)胞功能及其作用機(jī)制可能為臨床中肝纖維化的治療提供新思路。
　　腫瘤壞死因子樣配體1A（TNF-like ligand1 aberran

4、ce, TL1A）又稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子（vascular endothelial growth inhibitor, VEGI），是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤壞死因子家族新成員，主要有促進(jìn)炎癥反應(yīng)和抑制血管生成兩方面作用。對(duì)TL1A促進(jìn)炎癥反應(yīng)的研究主要集中在自身免疫性疾病領(lǐng)域，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥性腸病（inflammatory bowel disease, IBD）等。其中，在硫酸葡聚糖（dextran sulfa

5、te sodium， DSS）誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎模型中發(fā)現(xiàn)髓系單核細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞）高表達(dá)TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比腸纖維化程度更重，而應(yīng)用TL1A抗體干預(yù)可減輕腸道炎癥和纖維化，從而證實(shí)TL1A參與腸纖維化發(fā)生。近期在原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis, PBC）的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，PBC患者血清和肝組織中TL1A表達(dá)顯著高于正常人群，并進(jìn)一步在肝組織枯否細(xì)胞和浸潤(rùn)的單核細(xì)胞中

6、發(fā)現(xiàn)TL1A表達(dá)增加，提示TL1A可能參與肝纖維化發(fā)生。
　　TL1A與血管生成的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域。業(yè)已證實(shí)，TL1A通過(guò)抑制血管生成抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。血管生成在肝纖維化發(fā)生和逆轉(zhuǎn)階段發(fā)揮截然相反的作用。在肝纖維化發(fā)生時(shí)，肝細(xì)胞水腫、炎癥壞死造成局部組織缺氧促進(jìn)新生血管生成，有助于炎細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)發(fā)生，從而加重肝纖維化，在此過(guò)程中通過(guò)抑制血管生成可減輕肝纖維化程度。近期研究發(fā)現(xiàn)，血管生成利于巨噬細(xì)胞向肝臟募

7、集，在肝纖維化逆轉(zhuǎn)階段促進(jìn)ECM降解。但目前尚無(wú)TL1A及其相關(guān)的血管改變?cè)诟卫w維化逆轉(zhuǎn)中的研究。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò) CCl4腹腔注射構(gòu)建肝纖維化模型及其自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型，利用髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠作對(duì)比，探討髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A在肝纖維化發(fā)生和逆轉(zhuǎn)中的作用。提取兩種小鼠的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞，研究 TL1A對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。進(jìn)一步收集巨噬細(xì)胞上清液干預(yù)小鼠原代HSCs，探討TL1A高表達(dá)

8、巨噬細(xì)胞在HSCs膠原代謝中的作用。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下三部分：第一部分髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠肝纖維化發(fā)生的影響
　　目的：探討髓系細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞）高表達(dá)TL1A對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和肝纖維化程度的影響。
　　方法：將髓系細(xì)胞高表達(dá) TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠（ FMS-TL1A-GFP-transgenic, M-Tg）與有相同遺傳背景的C57BL/6野生型（wild type, WT）小鼠（6~8

9、周）隨機(jī)分為Control/WT組、Oil/WT組、CCl4/WT組、Control/Tg組、Oil/Tg組及CCl4/Tg組，每組10只。采用腹腔注射10％CCl4橄欖油溶液（5μL·g-1，每周二、五分別給藥一次）建立小鼠肝纖維化模型，并設(shè)立單純注射生理鹽水和橄欖油作為對(duì)照（Control）組和橄欖油溶劑對(duì)照（Oil）組。采用F4/80和TL1A免疫熒光雙標(biāo)記法檢測(cè)TL1A的定位分布，Real-time Q-PCR技術(shù)和Wester

10、n blot技術(shù)檢測(cè)TL1A在肝組織中的定量表達(dá)；自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠肝功能改變；Haematoxylin and eosin staining（H&E染色）觀察肝臟組織病理學(xué)改變；末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記（ terminal deoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling, TUNEL）法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況；天狼猩紅染色方法和羥脯氨酸檢測(cè)法評(píng)估肝纖維化程度

11、；免疫組織化學(xué)染色、Real-time Q-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)Collagen1α1和α-SMA表達(dá)變化；Real-time Q-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)MMP-2和MMP-9表達(dá)變化。
　　結(jié)果：1)應(yīng)用基因FMS-TL1A-GFP特定引物序列擴(kuò)增小鼠DNA后凝膠成像測(cè)定，Tg小鼠目的基因在191 bp位置成像，而WT小鼠在191 bp位置無(wú)目的基因表達(dá)，據(jù)此可以篩選鑒定髓系細(xì)胞高表

12、達(dá)TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠。2)小鼠肝纖維化模型成功建立：CCl4/WT組肝組織H&E染色可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)增多、小葉結(jié)構(gòu)紊亂、匯管區(qū)擴(kuò)大；天狼猩紅染色顯示纖維結(jié)締組織明顯增多。3) CCl4/WT組肝組織中TL1A和F4/80免疫熒光共染方法檢測(cè)到 TL1A表達(dá)于巨噬細(xì)胞中。檢測(cè) TL1A的平均光密度顯示， CCl4/WT組中平均光密度值顯著高于 Oil/WT組（0.031±0.005 vs0.021±0.003, P<0.01）；CCl4/

13、Tg組顯著高于CCl4/WT組（0.053±0.007 vs0.031±0.005, P<0.01）。Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中TL1A mRNA表達(dá)， CCl4/WT組中 TL1A mRNA的相對(duì)表達(dá)量（3.57±0.81）顯著高于Control/WT組（1±0.02）和 Oil/WT組（1.29±0.31），P<0.01；CCl4/Tg組的 TL1A mRNA相對(duì)表達(dá)量（11.5±1.87）顯著高于 Control/

14、Tg組（6.94±0.71）和Oil/Tg組（7.08±1.15），P<0.01；且CCl4/Tg組顯著高于CCl4/WT組（11.5±1.87 vs3.57±0.81, P<0.01）。Western blot分析各組TL1A蛋白表達(dá)， CCl4/WT組中 TL1A蛋白表達(dá)量（0.26±0.05）顯著高于Control/WT組（0.13±0.02）和Oil/WT組（0.15±0.05）；CCl4/Tg組中TL1A蛋白表達(dá)量（0.72±

15、0.08）顯著高于 Control/Tg組（0.36±0.04）和 Oil/Tg組（0.38±0.05），P<0.05；且CCl4/Tg組顯著高于CCl4/WT組（0.72±0.08 vs0.26±0.05, P<0.01）。4)生化法檢測(cè)各組肝功能變化，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間ALT、AST和TBIL水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05； CCl4/WT組肝功能損傷明顯重于 O

16、il/WT組（ALT：190.4 U/L±10.4 U/L vs8.3 U/L±3.7 U/L, P<0.05；AST：220.5 U/L±19.3 U/L vs58.5 U/L±14.5 U/L, P<0.05；TBIL：6μmol/L±1.07μmol/Lvs2.81μmol/L±0.66μmol/L, P<0.05）；CCl4/Tg組肝功能損傷明顯重于CCl4/WT組（ALT：222.4 U/L±5.2 U/L vs190.4 U

17、/L±10.4 U/L, P<0.05；AST：270.8 U/L±19.7 U/L vs220.5 U/L±19.3 U/L, P<0.05；TBIL：9.09μmol/L±0.9μmol/L vs6μmol/L±1.07μmol/L, P<0.05）。5) H&E染色觀察肝組織內(nèi)肝細(xì)胞壞死情況，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死；CCl4/WT組和CCl4/Tg組可見(jiàn)肝細(xì)胞水

18、腫、胞漿疏松化，肝內(nèi)匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加，匯管區(qū)及周圍碎屑樣壞死。壞死面積統(tǒng)計(jì)CCl4/Tg組較CCl4/WT組顯著升高（39.5%±5.1%vs25.8%±3.6%, P<0.05）。6) TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組每個(gè)視野下凋亡細(xì)胞的數(shù)量分別為4±1、5±2、5±1、4±1，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CCl4/WT組比Oil/WT組肝細(xì)胞凋亡明顯增多

19、（28±5 vs5±2，P<0.01），CCl4/Tg組比CCl4/WT組肝細(xì)胞凋亡顯著增加（46±6 vs28±5，P<0.01）。7)天狼猩紅染色陽(yáng)性面積百分比在Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和 Oil/Tg組依次為0.24%±0.05%、0.28%±0.08%、0.27%±0.04%、0.26%±0.06%，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P>0.05；CCl4/WT組的陽(yáng)性面積（1.43%±0.21%）

20、明顯高于 Oil/WT組， P<0.01；且CCl4/Tg組的陽(yáng)性面積（1.85%±0.14%）明顯高于CCl4/WT組， P<0.01。羥脯氨酸法檢測(cè)總膠原水平， Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組羥脯氨酸含量依次為83μg/g±5μg/g、89μg/g±7μg/g、86μg/g±8μg/g、92μg/g±10μg/g，各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P>0.05；CCl4/WT（130μg/g

21、±10μg/g）組較Oil/WT組羥脯氨酸含量明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組（162μg/g±14μg/g）較CCl4/WT組明顯升高， P<0.05。8)免疫組織化學(xué)染色、Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)各組Collagen1α1表達(dá)，在Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組間Collagen1α1表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；免疫組織化學(xué)染色方

22、法檢測(cè)Collagen1α1陽(yáng)性面積顯示CCl4/WT組（1.26%±0.31%）顯著高于Oil/WT組（0.3%±0.13%），P<0.01；CCl4/Tg組的陽(yáng)性染色面積顯著高于CCl4/WT組（2.96%±0.72%vs1.26%±0.31%, P<0.01）。Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中Collagen1α1 mRNA的表達(dá)，CCl4/WT組相對(duì)表達(dá)量（3.67±0.48）較Oil/WT組（1.24±0.2）明顯升

23、高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（5.08±0.72 vs3.67±0.48, P<0.01）；Western blot技術(shù)檢測(cè)各組Collagen1α1蛋白表達(dá)，CCl4/WT組（0.85±0.07）較Oil/WT組（0.68±0.08）Collagen1α1蛋白的表達(dá)量明顯升高, P<0.05；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（1.27±0.08 vs0.85±0.07, P<0.01）。9)免

24、疫組織化學(xué)染色、Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)各組α-SMA表達(dá)，在Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組間α-SMA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)， CCl4/WT組陽(yáng)性染色面積（2.73%±0.68%）顯著高于 Oil/WT組（0.34%±0.08%），P<0.01；CCl4/Tg組的陽(yáng)性染色面積顯著高于CCl

25、4/WT組（3.85%±0.65%vs2.73%±0.68%, P<0.05）。Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中α-SMA mRNA的表達(dá)，CCl4/WT組α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量（3.18±1.25）較Oil/WT組（1.17±0.16）明顯升高，P<0.05；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（4.6±0.6 vs3.18±1.25, P<0.05）。Western blot技術(shù)檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)， C

26、Cl4/WT組（1.35±0.11）較Oil/WT組（1.01±0.08）α-SMA蛋白的表達(dá)量明顯升高，P<0.05；CCl4/Tg組較 CCl4/WT組明顯升高（1.63±0.1 vs1.35±0.11, P<0.01）。10) Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中MMP-2的表達(dá)，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05；MM

27、P-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在CCl4/WT組（5.3±1.6）較Oil/WT組（1.02±0.23）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（10.4±2.8 vs5.3±1.6, P<0.01）。MMP-2蛋白表達(dá)在CCl4/WT組（1.15±0.11）較Oil/WT組（0.55±0.08）明顯升高， P<0.01；CCl4/Tg組較 CCl4/WT組明顯升高（1.31±0.06 vs1.15±0.11,

28、P<0.05）。11) Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中MMP-9的表達(dá)， Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05；MMP-9 mRNA的表達(dá)在CCl4/WT組（4.99±1.73）較Oil/WT組（1.08±0.14）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（9.97±1.97 vs4.99±1.7

29、3, P<0.01）。MMP-9蛋白表達(dá)在CCl4/WT組（0.51±0.09）較 Oil/WT組（0.22±0.04）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（0.72±0.12 vs0.51±0.09, P<0.05）。
　　第二部分 TL1A高表達(dá)的巨噬細(xì)胞參與肝纖維化進(jìn)程的機(jī)制
　　目的：探討TL1A高表達(dá)的巨噬細(xì)胞參與肝纖維進(jìn)程的體內(nèi)外機(jī)制。
　　方法：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組同第一部分。巨噬細(xì)

30、胞功能檢測(cè)部分，分別提取野生型 C57BL/6小鼠和髓系細(xì)胞高表達(dá) TL1A的轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（ bone marrow-derived macrophage, BMMs）和腹腔巨噬細(xì)胞（peritoneal macrophages, PMs），分組如下：PMs分組：Control/WT組、LPS+IFN-γ/WT組、Control/Tg組、LPS+IFN-γ/Tg組，其中Control組為提取出 PMs后用含10%胎牛血清的

31、 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h；LPS+IFN-γ組為提取出PMs后用含100 ng/mL脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）和25 ng/mL干擾素-γ（interferon, IFN-γ）培養(yǎng)72 h；BMMs分組：Control/WT組、M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組、Control/Tg組、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組，首先提取出骨髓造血干細(xì)胞，應(yīng)用含10 ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子（

32、macrophage colony stimulating factor, M-CSF）的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)9天誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，Control組為繼續(xù)應(yīng)用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，M-CSF+LPS+IFN-γ組為應(yīng)用含10 ng/mL M-CSF、100 ng/mL LPS和25 ng/mL IFN-γ的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。收集上述分組中的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基用于細(xì)胞因子檢測(cè)和作為干預(yù)HSCs的

33、條件培養(yǎng)基（conditioned medium, CM）。應(yīng)用原位循環(huán)灌流和密度梯度離心技術(shù)分離野生型小鼠HSCs，用BMMs和PMs的條件養(yǎng)基干預(yù)，實(shí)驗(yàn)分組如下。PMs的CM干預(yù)HSCs分組：Control組（用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）；LPS+IFN-γ組（用含40 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）；CM/WT組（用含40%野生型

34、小鼠PMs CM的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）；CM/Tg組（用含40%轉(zhuǎn)基因小鼠PMs CM的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）。BMMs的CM干預(yù)HSCs分組：Control組（用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）；M-CSF+LPS+IFN-γ組（用含4 ng/mL M-CSF、40 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基

35、培養(yǎng)HSCs24 h）；CM/WT組（用含40%野生型小鼠BMMs CM的10%胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HSCs24 h）；CM/Tg組（用含40%轉(zhuǎn)基因小鼠BMMs CM的10%胎牛血清 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng) HSCs24 h）。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和Real time Q-PCR方法檢測(cè)肝組織中 F4/80表達(dá)。Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中C-C趨化因子配體2（C–C chemok

36、ine ligand2, CCL2）表達(dá)。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)血清、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基，Real time Q-PCR方法檢測(cè)肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor beta, TGF-β1）、血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB（platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）和白介素-1β（

37、interleukin-1β, IL-1β）表達(dá)。Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)HSCs中 Collagen1α1、MMP-13和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP-1）表達(dá)。
　　結(jié)果：1) Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中F4/80 mRNA的相對(duì)表達(dá)量， Control/WT組（1±

38、0.12）、Oil/WT組（1.16±0.22）、Control/Tg組（1.23±0.2）和Oil/Tg組（1.3±0.18）之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；CCl4/WT組（3.95±0.9）較Oil/WT組F4/80 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（6.3±0.95 vs3.95±0.9, P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)各組 F4/80表達(dá)，Control/W

39、T組、Oil/WT組、Control/Tg組和 Oil/Tg組 F4/80陽(yáng)性染色面積依次為：0.98%±0.23%、1.03%±0.31%、1.02%±0.16%、1%±0.29%，各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P>0.05；CCl4/WT組陽(yáng)性染色面積（3.7%±1.1%）顯著高于Oil/WT組， P<0.01；且CCl4/Tg組的陽(yáng)性染色面積顯著高于CCl4/WT組（6.52%±1.74%vs3.7%±1.1%, P<0.01）。2

40、) Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中CCL2表達(dá)，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；CCl4/WT組（5.7±1.6）較Oil/WT組（1.17±0.37）CCL2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（10.74±2.87 vs5.7±1.6, P<0.05）。CC

41、L2蛋白在CCl4/WT組（1.25±0.12）較Oil/WT組（0.85±0.07）表達(dá)量明顯升高， P<0.01；CCl4/Tg組較 CCl4/WT組明顯升高（1.81±0.16 vs1.25±0.12, P<0.01）。3)成功提取小鼠骨髓造血干細(xì)胞，并誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，成功提取并純化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞；通過(guò)LPS聯(lián)合IFN-γ促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化，從而獲得活化的高表達(dá) TL1A巨噬細(xì)胞和野生型巨噬細(xì)胞。4) ELISA方法檢測(cè)血清中

42、 TGF-β1含量、Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中TGF-β1 mRNA的表達(dá)，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；血清TGF-β1含量在CCl4/WT組（184 pg/ml±17.3 pg/ml）較Oil/WT組（89.1 pg/ml±7.4 pg/ml）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較 CCl4/WT組明顯升高（253.6 pg/m

43、l±11.4 pg/ml vs184pg/ml±17.3 pg/ml, P<0.01）。肝組織中TGF-β1 mRNA的表達(dá)在CCl4/WT組（3.83±1.23）較 Oil/WT組（1.22±0.33）明顯升高，P<0.05；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（6.45±1.35 vs3.83±1.23, P<0.05）。ELISA方法檢測(cè) BMMs上清液中 Control/WT組、 Control/Tg組、M-CSF+LPS

44、+IFN-γ/WT組、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組TGF-β1含量依次為2679.73 pg/ml±167.01 pg/ml、2495.08 pg/ml±264.47 pg/ml、2515.08 pg/ml±164.47 pg/ml、2572.08 pg/ml±216.35 pg/ml，4組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。檢測(cè)PMs上清液中TGF-β1含量，與BMMs結(jié)果趨勢(shì)一致。5)采用ELISA方法檢測(cè)血清中PDGF-

45、BB含量、Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中 PDGF-BB mRNA的表達(dá)， Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和 Oil/Tg組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P>0.05；血清PDGF-BB含量在CCl4/WT組（2253.2 pg/ml±297.4 pg/ml）較Oil/WT組（601.7 pg/ml±121.7 pg/ml）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（300

46、8.7 pg/ml±295.9 pg/ml vs2253.2 pg/ml±297.4 pg/ml, P<0.01）。PDGF-BB mRNA的相對(duì)表達(dá)量在CCl4/WT組（2.04±0.57）較Oil/WT組（1.07±0.14）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（3.04±0.33 vs2.04±0.57, P<0.01）。ELISA方法檢測(cè)BMMs培養(yǎng)液上清中PDGF-BB含量，Control/WT組

47、（7838.38 pg/ml±882.11 pg/ml）與Control/Tg組（8320.44 pg/ml±1038.59 pg/ml）相比無(wú)明顯差異，P>0.05；而 M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組比 M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組明顯升高（15447.36 pg/ml±1129.50 pg/ml vs11464.79 pg/ml±1402.97 pg/ml, P<0.01）。檢測(cè)PMs上清液中PDGF-BB含量，與

48、BMMs結(jié)果趨勢(shì)一致。6)采用ELISA方法檢測(cè)血清中TNF-α含量、Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中TNF-αmRNA的表達(dá)，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；TNF-α含量在CCl4/WT組（61.2 pg/ml±11.8 pg/ml）較Oil/WT組（26.9 pg/ml±5.8 pg/ml）明顯升高， P<0.01；CCl4/Tg組較CC

49、l4/WT組明顯升高（104 pg/ml±18.4 pg/ml vs61.2 pg/ml±11.8 pg/ml, P<0.01）。TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量在CCl4/WT組（4.97±0.8）較Oil/WT組（1.09±0.4）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（8.8±2.5 vs4.97±0.8, P<0.05）。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè) BMMs上清液中 TNF-α含量， Control/WT

50、組、Control/Tg組、M-CSF+LPS+ IFN-γ/WT組、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組依次為182.19 pg/ml±54.74 pg/ml、195.33 pg/ml±45.57 pg/ml、4128.07 pg/ml±331.40 pg/ml、4613.5 pg/ml±238.15 pg/ml，其中Control/Tg組略高于Control/WT組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；M-CSF+LPS+IFN-γ

51、/WT組明顯高于Control/WT組，P<0.01；M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組明顯高于M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組（4613.5 pg/ml±238.15 pg/ml vs4128.07 pg/ml±331.40 pg/ml, P<0.05）。檢測(cè)PMs上清液中TNF-α含量，與BMMs結(jié)果趨勢(shì)一致。7)采用ELISA方法檢測(cè)血清中IL-1β含量、Real time Q-PCR檢測(cè)肝組織中pro-IL-1β mR

52、NA的表達(dá)，Control/WT組、Oil/WT組、Control/Tg組和Oil/Tg組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；血清中IL-1β含量在CCl4/WT組（43.5 pg/ml±9.1 pg/ml）較Oil/WT組（29.3 pg/ml±4.7 pg/ml）明顯升高，P<0.05；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（64.6 pg/ml±11.3 pg/ml vs43.5 pg/ml±9.1 pg/ml, P<0.0

53、1）。Pro-IL-1βmRNA的相對(duì)表達(dá)量在CCl4/WT組（4.89±0.68）較Oil/WT組（1.12±0.4）明顯升高，P<0.01；CCl4/Tg組較CCl4/WT組明顯升高（5.93±0.55 vs4.89±0.68, P<0.05）。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè) BMMs培養(yǎng)液上清中 IL-1β含量， Control/WT組（34.57 pg/ml±3.11 pg/ml）與Control/Tg組（36.62 pg/ml±3.5

54、4 pg/ml）相比無(wú)顯著性差異，P>0.05；而M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg組比M-CSF+LPS+IFN-γ/WT組增加明顯（121.08 pg/ml±6.68 pg/ml vs94.10 pg/ml±5.19 pg/ml, P<0.01）。檢測(cè)PMs上清液中IL-1β含量，與BMMs結(jié)果趨勢(shì)一致。8)應(yīng)用原位灌注、密度梯度離心法分離小鼠原代HSCs，熒光顯微鏡（波長(zhǎng)328 nm）觀察可見(jiàn)初分離的小鼠原代HSCs由于富含維生

55、素 A脂滴，呈自發(fā)藍(lán)綠色熒光；應(yīng)用Desmin免疫熒光染色鑒定分離出的HSCs，在倒置熒光顯微鏡下陽(yáng)性細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)綠色熒光，Desmin染色陽(yáng)性率約93%。9)應(yīng)用BMMs條件培養(yǎng)基干預(yù)原代HSCs24 h后，Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)HSCs中Collagen1α1的表達(dá)，M-CSF+LPS+IFN-γ組與Control組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P>0.05；CM/WT組（1.88±0.14）

56、較M-CSF+LPS+IFN-γ組（1.06±0.08）Collagen1α1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，P<0.01；CM/Tg組中Collagen1α1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較CM/WT組明顯升高（2.65±0.18 vs1.88±0.14, P<0.01）。CM/WT組Collagen1α1蛋白定量（0.74±0.07）較M-CSF+LPS+IFN-γ組（0.53±0.05）明顯升高，P<0.01；CM/Tg組Collagen

57、1α1蛋白定量較CM/WT組明顯升高（0.96±0.14 vs0.74±0.07, P<0.01）。應(yīng)用 PMs條件培養(yǎng)基干預(yù)后檢測(cè) HSCs中Collagen1α1表達(dá)趨勢(shì)與BMMs相一致。10)應(yīng)用BMMs條件培養(yǎng)基干預(yù)原代HSCs24 h后，Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)HSCs中MMP-13的表達(dá)，M-CSF+LPS+IFN-γ組與 Control組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；CM/W

58、T組的MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)量（0.84±0.12）明顯低于M-CSF+LPS+IFN-γ組（1.03±0.04），P<0.05；CM/Tg組中MMP-13 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（0.77±0.08）與CM/WT組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P>0.05。CM/WT組中 MMP-13蛋白表達(dá)量（0.35±0.06）比M-CSF+LPS+IFN-γ組（0.46±0.03）明顯下降，P<0.01；CM/Tg組中MMP-13蛋白表達(dá)量（0

59、.37±0.04）與CM/WT組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。應(yīng)用PMs條件培養(yǎng)基干預(yù)后檢測(cè)HSCs中MMP-13表達(dá)，趨勢(shì)與BMMs相一致。11)應(yīng)用BMMs條件培養(yǎng)基干預(yù)原代HSCs24 h后，Real time Q-PCR和 Western blot方法檢測(cè) HSCs中 TIMP-1的表達(dá)， M-CSF+LPS+IFN-γ組與 Control組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；CM/WT組的 TIMP-1 mRNA相對(duì)表

60、達(dá)量（1.79±0.07）明顯高于M-CSF+LPS+IFN-γ組（1.04±0.05），P<0.01；CM/Tg組中TIMP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較CM/WT組明顯升高（2.14±0.16 vs1.79±0.07, P<0.01）。CM/WT組中 TIMP-1蛋白表達(dá)量（0.62±0.1）比 M-CSF+LPS+IFN-γ組（0.35±0.06）明顯升高， P<0.01；CM/Tg組中 TIMP-1蛋白表達(dá)量較CM/WT組明顯升高

61、（0.85±0.12 vs0.62±0.1, P<0.01）。應(yīng)用PMs條件培養(yǎng)基干預(yù)后檢測(cè)HSCs中TIMP-1表達(dá)，趨勢(shì)與BMMs相一致。
　　第三部分髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A在實(shí)驗(yàn)性小鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的作用
　　目的：探討髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A對(duì)小鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)、血管生成及巨噬細(xì)胞募集的影響。
　　方法：將Tg小鼠與WT小鼠隨機(jī)分為Oil/WT組（每周2次腹腔注射橄欖油溶液5μL·g-1，持續(xù)6周）、CCl46

62、 wk/WT組（每周2次腹腔注射10%CCl4橄欖油溶液5μL·g-1，持續(xù)6周）、CCl4 Re1 wk/WT組（完成上述肝纖維化造模后停藥恢復(fù)1周，分組中用Re代替逆轉(zhuǎn)reversion）、CCl4 Re2 wk/WT組（完成上述肝纖維化造模后停藥恢復(fù)2周）、Oil/Tg組（處理方式同Oil/WT組）、CCl46 wk/Tg組（處理方式同CCl46 wk/WT組）、CCl4 Re1 wk/Tg組（處理方式同CCl4 Re1 wk/W

63、T組）、CCl4 Re2 wk/Tg組（處理方式同CCl4 Re2 wk/WT組），每組各10只。應(yīng)用天狼猩紅染色和羥脯氨酸檢測(cè)了解纖維組織降解情況；免疫組織化學(xué)染色、Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織Collagen1α1表達(dá)；免疫熒光法和 Western blot方法檢測(cè)血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1（ Platelet endothelial cell adhesion molecule1, PECA

64、M-1）也稱為分化抗原簇31（cluster of differentiation31, CD31）表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織中F4/80表達(dá)；Real time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中MMP-13和TIMP-1表達(dá)。
　　結(jié)果：1)天狼猩紅染色后統(tǒng)計(jì)各組中纖維結(jié)締組織所占面積百分比， Oil/WT組與 Oil/Tg組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.27%±0.06% vs0.25%±0.08%, P＞

65、0.05）；CCl46 wk/Tg組、CCl4 Re1 wk/Tg組和CCl4 Re2 wk/Tg組均明顯高于相對(duì)應(yīng)的CCl46 wk/WT組、CCl4 Re1 wk/WT組和CCl4 Re2 wk/WT組；CCl4 Re1 wk/Tg組天狼猩紅染色陽(yáng)性面積百分比較CCl46 wk/Tg組下降約1.07%，CCl4 Re1 wk/WT組較CCl46 wk/WT組下降約1.08%；CCl4 Re2 wk/Tg組天狼猩紅染色陽(yáng)性面積百分比較

66、CCl4 Re1 wk/Tg組下降約0.52%，CCl4 Re2 wk/WT組天狼猩紅染色陽(yáng)性面積百分比較CCl4 Re1 wk/WT組下降約0.83%。檢測(cè)各組羥脯氨酸含量，Oil/WT組與Oil/Tg組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（92μg/g±10μg/g vs89μg/g±7μg/g, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg組、CCl4 Re1 wk/Tg組和CCl4 Re2 wk/Tg組均明顯高于相對(duì)應(yīng)的CCl46 wk/WT組、CC

67、l4 Re1 wk/WT組和CCl4 Re2 wk/WT組；CCl4 Re1 wk/WT組羥脯氨酸含量較CCl46 wk/WT組下降約23μg/g，而CCl4 Re1 wk/Tg組較CCl46 wk/Tg組下降約17μg/g；CCl4 Re2 wk/WT組羥脯氨酸含量較CCl4 Re1 wk/WT組下降約42μg/g，而CCl4 Re2 wk/Tg組較CCl4 Re1 wk/Tg組下降約31μg/g。2)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Real

68、time Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)肝組織中Collagen1α1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Oil/WT組與Oil/Tg組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CCl46 wk/Tg組、CCl4 Re1 wk/Tg組和CCl4 Re2 wk/Tg組中Collagen1α1表達(dá)均明顯高于相對(duì)應(yīng)的CCl46 wk/WT組、CCl4 Re1 wk/WT組和CCl4 Re2 wk/WT組。3)免疫組織熒光染色和Western blot檢測(cè)CD31表達(dá)，O

69、il/Tg組、CCl46 wk/Tg組、CCl4 Re1 wk/Tg組和CCl4 Re2 wk/Tg組中CD31表達(dá)均明顯低于相對(duì)應(yīng)的Oil/WT組、CCl46 wk/WT組、CCl4 Re1 wk/WT組和CCl4 Re2 wk/WT組。4)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝組織中F4/80表達(dá)，Oil/Tg組與Oil/WT組之間F4/80陽(yáng)性染色面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.13%±0.37%vs1.15%±0.4%, P＞0.05）；CCl46

70、wk/Tg組與CCl46 wk/WT組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（3.22%±0.27%vs2.82%±0.36%, P＞0.05）；CCl4 Re1 wk/Tg組F4/80陽(yáng)性染色面積明顯低于CCl4 Re1 wk/WT組（4.04%±0.47% vs5.98%±1.32%, P＜0.05）；CCl4 Re2 wk/Tg組F4/80陽(yáng)性染色面積明顯低于CCl4 Re2 wk/WT組（1.91%±0.29%vs2.32%±0.22%, P＜0

71、.05）。5) Real time Q-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)各組中MMP-13表達(dá)，Oil/WT組與Oil/Tg組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05；CCl46 wk/Tg組與CCl46 wk/WT組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05；MMP-13 mRNA在CCl4 Re1 wk/Tg組明顯低于CCl4 Re1 wk/WT組（3.58±0.4 vs4.54±0.43, P＜0.01）；MMP-13 mRNA在CCl4

72、Re2 wk/Tg組明顯低于CCl4 Re2 wk/WT組（1.85±0.3 vs2.28±0.24, P＜0.05）。MMP-13蛋白檢測(cè)與上述檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致。6)采用Real time Q-PCR檢測(cè)各組中TIMP-1 mRNA表達(dá)，Oil/WT組與Oil/Tg組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.03±0.33 vs0.95±0.04, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg組TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于CCl46 wk/WT

73、組（5.21±0.53 vs4.14±0.56, P＜0.01）；CCl4 Re1 wk/Tg組TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于CCl4 Re1 wk/WT組（4.12±0.62 vs3±0.44, P＜0.01）；CCl4 Re2 wk/Tg組TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于CCl4 Re2 wk/WT組（2.39±0.54 vs1.6±0.17, P＜0.05）。Western blot技術(shù)檢測(cè)各組中TIMP-1蛋白

74、表達(dá)，結(jié)果顯示：Oil/Tg組與 Oil/Tg組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.32±0.05 vs0.35±0.06, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg組TIMP-1蛋白表達(dá)明顯高于CCl46 wk/WT組（0.92±0.1 vs0.64±0.06, P＜0.01）；CCl4 Re1 wk/Tg組TIMP-1蛋白表達(dá)明顯高于CCl4 Re1 wk/WT組（0.78±0.07 vs0.47±0.05, P＜0.01）；CCl4 Re2

75、wk/Tg組 TIMP-1蛋白表達(dá)明顯高于 CCl4 Re2 wk/WT組（0.55±0.1 vs0.38±0.06, P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1在 CCl4誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性小鼠肝纖維化模型肝組織中和巨噬細(xì)胞內(nèi)TL1A表達(dá)明顯升高。
　　2在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中，髓系細(xì)胞高表達(dá)TL1A可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向肝臟募集，加重肝功能損傷、肝細(xì)胞壞死和凋亡；上調(diào)肝組織中TGF-β1、PDGF-BB、TNF-α和IL-1β表達(dá)，從