基于kl-FGF-23信號(hào)通路探討滋陰補(bǔ)腎法對(duì)衰老大鼠模型骨-腎內(nèi)分泌軸的影響.pdf

1、人口老齡化已經(jīng)成為我國(guó)嚴(yán)峻的社會(huì)問(wèn)題，而Klotho基因被認(rèn)為是衰老抑制基因,與FGF-23具有共同受體，具有調(diào)節(jié)血鈣、磷的作用，并有抗氧化作用。本研究主要觀察滋陰補(bǔ)腎法對(duì)衰老大鼠模型骨-腎內(nèi)分泌軸的影響。
　　目的：
　　基于Klotho（Kl）基因/FGF-23信號(hào)通路研究滋陰補(bǔ)腎法對(duì)衰老大鼠模型骨-腎內(nèi)分泌軸的影響。
　　方法：
　　造模方法：選取健壯的Wistar雄性大鼠40只，體重(200±20) g，

2、按照隨機(jī)表分為正常組、模型組、中藥滋陰補(bǔ)腎組和西藥陽(yáng)性對(duì)照（維生素E）組四個(gè)組，四組中的大鼠樣本數(shù)量相等，均為10只，進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，使用D-半乳糖誘導(dǎo)衰老法造模，將D-半乳糖25g溶解于0.9％氯化鈉液500ml中，用500mg／kg腹腔注射劑量（0.01ml／g）給予大鼠腹腔注射，正常對(duì)照組腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉注射液（0.01ml／g），每周稱量體重1次，依據(jù)末次稱量的體重調(diào)整給藥劑量，造模時(shí)間為8周。

3、>　　給藥方法：在建模開(kāi)始同時(shí)灌胃，空白對(duì)照組、模型組生理鹽水體積的一樣，一天1次。中藥滋陰補(bǔ)腎組每日灌服劑量為3.24g/kg，給藥容量為1ml/100g。灌胃西藥陽(yáng)性對(duì)照（維生素 E）組0.027g/kg。每個(gè)星期一計(jì)算大鼠體重給藥，最后根據(jù)體重調(diào)整藥物劑量。
　　檢測(cè)指標(biāo):(1)血尿素氮(Bun)、血肌酐(Scr)、鈣(Ca2+)磷(P3+)水平,取血前1天代謝籠收集24h尿,測(cè)尿肌酐(Ucr)并計(jì)算肌酐清除率(Ccr);(

4、2)檢測(cè)腎組織超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，一氧化氮(NO)，一氧化氮合成酶(NOS)的水平;（3）觀察大鼠的體重、飲食、毛發(fā)、活動(dòng)力及有無(wú)死亡。
　　檢測(cè)方法：(1)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血FGF-23(fibroblast growth factor-23)的水平；（2）Western Blot檢測(cè)大鼠腎皮質(zhì)klotho蛋白，股骨FGF-23蛋白水平;(3)采用Real-timePCR檢測(cè)大鼠腎臟klo

5、thoRNA的表達(dá);（4）觀察腎臟的病理變化；（5）采用免疫熒光法檢測(cè)FGF23的表達(dá)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用( x?s)表示，組間比較采用單因素方差分析。
　　結(jié)果：
　　（1）正常對(duì)照組大鼠攝食正常，毛發(fā)光亮，濃密，皮膚彈性好活潑好動(dòng)，不易捉取。D-半乳糖從腹腔注射后，造模對(duì)照組大鼠逐步出現(xiàn)毛色萎黃，無(wú)光澤，掉毛嚴(yán)重，大便稀溏，飲食明顯削減，行動(dòng)緩慢，反應(yīng)和活動(dòng)能力

6、差，生殖器萎縮，與自然衰老大鼠的癥狀類(lèi)似，提示 D-半乳糖組大鼠出現(xiàn)明顯衰老體征。當(dāng)造模8w后，B組與A組相比，體重明顯下降，有顯著性差別(P＜0.01)，經(jīng)過(guò)藥物治療后，C組和D組與B組比較，體重明顯上升，但C組與D組之間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1）。
　　（2）對(duì)各組大鼠用藥后BUN、Scr、Ccr檢測(cè)結(jié)果顯示：B組跟A組相比，血 BUN、Scr明顯升高，；內(nèi)生肌酐清除率顯著降低（P＜0.01）。經(jīng)藥物干預(yù)治療后，C、D組與B組

7、相比較，血BUN、Scr明顯下降，Ccr明顯上升（P＜0.01）。而D組與C組之間相比較，血BUN、Scr與略有降低，Ccr略有升高，但兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）對(duì)各組大鼠用藥后血Ca2+、P3+、ALP檢測(cè)結(jié)果比較：B組與A組相比，ALP、P3+增加，Ca2+顯著下降（P＜0.01）。經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)治療后， C組、D組Ca2+、P3+、ALP與B組相比有顯著性差異（P＜0.01）。而C、D組比較比較無(wú)差別（

8、P>0.05）。
　?。?）檢測(cè)各組大鼠外周血 FGF-23的水平，結(jié)果顯示：（1）D-半乳糖腹腔注射后，B組FGF-23水平有明顯上升的趨勢(shì)，與A組對(duì)比，有顯著性差異（P<0.01）。（2）經(jīng)過(guò)治療后，C、D組的FGF-23的水平較B組相比明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但是C組和D組之間比較無(wú)明顯差異性（P>0.05），兩組與A組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）對(duì)各組大鼠腎組織SOD活性測(cè)定，結(jié)果顯

9、示：（1）造模后，造模B組大鼠腎SOD的活力相比A組明顯降低（P<0.01），各治療組的指標(biāo)大大調(diào)高，與之對(duì)比亦有差別（P<0.01），說(shuō)明大鼠腎組織SOD活性隨老化而下降，而各治療組具有提高其活性的功用。（2）C組、D組能升高SOD活性，但與正常組比較，結(jié)果仍有所下降（P<0.05）。
　　（6）對(duì)各組大鼠腎組織丙二醛含量的測(cè)定，結(jié)果顯示：(1)造模后，造模組大鼠腎組織 MDA的測(cè)定較正常組上升，有可比性（P<0.01），各治療

10、組的MDA含量明顯下降，具有可比性（P<0.01，P<0.05），說(shuō)明大鼠衰老以后，腎組織MDA含量顯著升高，而各治療組均有下調(diào)MDA的作用。(2)與A組比較，D組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而C組與A組相比較，具有可比性（P<0.05）。
　?。?）對(duì)各組大鼠血清NO的檢測(cè)，結(jié)果表明：(1)造模后，B組大鼠血 NOS的測(cè)定明顯升高，與 A組比較有差異性（P<0.01），各治療組的測(cè)定出現(xiàn)顯著的下降情況，對(duì)比治療前來(lái)看存在統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義（P<0.05），這就說(shuō)明對(duì)大鼠進(jìn)行誘導(dǎo)衰老操作后，大鼠血清中出現(xiàn)了更多的 NOS，經(jīng)過(guò)治療后NOS的含量明顯下降。（2）治療組和正常組的對(duì)照存在顯著性差異，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明利用D-半乳糖能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)大鼠的誘導(dǎo)衰老，并造成NOS在血清中含量的增加，各個(gè)治療組的NOS均得到了不同程度的降低，但難以恢復(fù)到衰老前的水平。
　?。?）通過(guò)完成大鼠股骨骨密度檢測(cè)，結(jié)果顯示B組較A組明顯降低（P<0.05），C組與D

12、組相比較無(wú)明顯區(qū)別（P>0.05）。經(jīng)過(guò)藥物治療后， C組和D組與B組相比骨密度明顯升高（P<0.05）。
　?。?）通過(guò)Western blot檢測(cè)腎臟kl表達(dá)水平，結(jié)果表明A組高于B組（P<0.01），C組與D組kl蛋白的表達(dá)與B組相對(duì)比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?0）通過(guò)Western blot檢測(cè)股骨FGF-23蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)股骨FGF-23蛋白表達(dá)水平B組明顯高于A組（P<0.01）。經(jīng)過(guò)藥物

13、治療后，C組和D組與B組相比FGF-23蛋白水平明顯下降（P<0.01）。
　　（11）各組大鼠股骨FGF-23免疫熒光結(jié)果顯示，各組大鼠股骨熒光所見(jiàn)紅染為 FGF-23陽(yáng)性表達(dá)，B組 FGF-23陽(yáng)性表達(dá)較 A組明顯增強(qiáng)（P<0.05）；C組、D組陽(yáng)性表達(dá)較B組減輕（P<0.05）。以彩色圖像展示其相對(duì)吸光度，B組較A組顯明提高（P<0.05）。C組、D組與B組比較明顯下降（P<0.05），D組與C組相比雖有下降但沒(méi)有意義（P>

14、0.05）。
　?。?2）運(yùn)用熒光定量PCR計(jì)算大鼠腎皮質(zhì)中的klothomRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：A組腎皮質(zhì)kl蛋白的表現(xiàn)顯明高過(guò)B、C、D組，B組跟A組相比大大下降（P＜0.01），C組與D組kl蛋白的表達(dá)與B組相比上抬（P＜0.01），C組與D組之間相比無(wú)差異性（P>0.05）。
　　（13）在滋陰補(bǔ)腎組大鼠腎組織的細(xì)胞形態(tài)均在一定程度上恢復(fù)的治療效果，光鏡下觀察，與模型組相比有明顯的變化；電鏡下造模組腎小球基底膜具有

15、變厚、萎縮的特點(diǎn),系膜的基質(zhì)發(fā)生增多,血管腔堵塞等癥狀;腎小球上皮細(xì)胞足突廣泛融合發(fā)生變性，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹細(xì)胞腔，核收縮發(fā)生變化甚至核破裂;上皮下有電子致密物沉積，六味地黃丸組對(duì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改善較為明顯。
　　結(jié)論:腎虛是衰老之根本,其中以腎精（陰）虧虛為本,故治療大法,當(dāng)以滋補(bǔ)腎陰（精）為先。六味地黃丸為滋養(yǎng)補(bǔ)腎陰（精）的代表方，作用緩和，療效確切。促進(jìn)機(jī)體的抗氧化能力、同時(shí)維持腎臟組織細(xì)胞的正常形廓來(lái)實(shí)現(xiàn);對(duì)腎組織的 K