糖尿病大鼠腎組織Nrf2、HO-1的表達及富氫液對其干預作用的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病是糖尿病最常見、最嚴重的慢性并發(fā)癥之一，其具體發(fā)病機制尚未完全闡明，但大量研究表明，糖尿病持續(xù)的高糖狀態(tài)誘導產(chǎn)生的大量活性氧（Reactive oxygen species, ROS）可直接攻擊體內(nèi)大分子物質(zhì)，產(chǎn)生過氧化變性、交聯(lián)或斷裂，導致細胞結(jié)構(gòu)和功能損傷，從而促使糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。當機體應對ROS損傷時，某些保護性基因上游調(diào)節(jié)區(qū)的抗氧化反應元件(Anti-oxidative response element,

2、 ARE)會調(diào)控表達一系列保護性蛋白，以緩解細胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)，ARE可被細胞內(nèi)調(diào)節(jié)抗氧化應激反應的重要轉(zhuǎn)錄因子Nrf2激活。Nrf2/ARE通路是維持細胞內(nèi)氧化還原平衡的主要內(nèi)源性通路。因此，Nrf2的激活及下游抗氧化蛋白的表達可能為糖尿病腎病的防治提供新的靶點。本研究擬建立糖尿病大鼠模型，并給予富氫液進行干預，測定腎組織中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、谷胱甘肽（glutathione hormone,GSH

3、）水平及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性反應糖尿病大鼠腎臟氧化應激程度；應用免疫組織化學、Western blot方法檢測腎組織中Nrf2、HO-1的表達情況。探討富氫液是否能通過激活Nrf2/ARE通路改善腎組織內(nèi)的氧化應激狀態(tài)，以期為糖尿病腎病的防治提供新的理論依據(jù)。
　　方法：選擇SPF級健康雄性大鼠36只，體重約200±20g，適應性喂養(yǎng)1周后，空腹12小時，隨機選取12只，作為正常組

4、（NC組），其余24只建立糖尿病大鼠模型，分別給予STZ（65mg/Kg）腹腔注射,72小時后尾尖取血測血糖，血糖≥16.7mmol/L即為造模成功。NC組給予等量的檸檬酸緩沖液腹腔注射。糖尿病大鼠隨機分為糖尿病模型組(DM組)、富氫液干預組(HRS組)。HRS組給予12ml/kg HRS灌胃，NC組、DM組每天給予等量生理鹽水灌胃。實驗期間大鼠自由進食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。分別于造模成功8周末、12周末，每組任取6只大鼠

5、，留取血、尿標本，檢測血肌酐、血尿素氮及24小時尿蛋白；并取腎組織，制作病理切片，進行蘇木素伊紅（HE）染色及糖原染色（PAS），觀察腎組織病理變化；應用免疫組織化學方法及Western blot方法檢測Nrf2、HO-1的表達情況。取部分腎皮質(zhì)制備勻漿液，測定MDA、GSH水平及SOD活性。實驗所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(?x±S)表示，應用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性或方差齊性則采用非參數(shù)檢驗

6、，以p<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠一般情況
　　NC組大鼠精神狀態(tài)良好，體重增加，反應靈敏，毛發(fā)有光澤，尿量無明顯改變。DM組及HRS組自造模成功后，逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿等糖尿病癥狀，后期精神萎靡，反應遲鈍，毛發(fā)晦暗且逐漸消瘦。其中DM癥狀明顯重于HRS組。
　　2.生化指標
　　8周末和12周末，DM組和HRS組24小時尿蛋白、血糖、血肌酐、血尿素氮水平較NC組升高（P＜0.05

7、）；HRS組與DM組相比明顯降低（P＜0.05）。
　　3.氧化應激指標
　　DM組大鼠腎組織內(nèi)MDA含量與NC組相比明顯升高，給予富氫液干預后，MDA水平降低（P＜0.05）；DM組大鼠腎組織內(nèi)SOD活性、GSH水平與NC相比明顯降低，給予富氫液干預后，SOD活性、GSH水平升高（P＜0.05）。
　　4.腎臟形態(tài)學改變
　　光鏡顯示，NC組大鼠的腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯的病理學改變；DM組部分腎小球體積增大

8、，腎小球系膜基質(zhì)彌漫增多，系膜細胞增生，系膜區(qū)增寬，基底膜增厚，部分部位出現(xiàn)腎小管擴張，部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡變性。12周末上述病理改變最明顯，給予富氫液治療后，腎臟病變有所減輕。
　　5.Nrf2、HO-1的表達
　　免疫組織化學結(jié)果顯示：Nrf2、HO-1主要表達于腎小管上皮細胞胞漿中,表達強度為：HRS組＞DM組＞NC組（P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示：Nrf2、HO-1的表達趨勢與免疫組織化學結(jié)

9、果一致。
　　結(jié)論：
　　1.糖尿病狀態(tài)下，大鼠腎組織GSH水平、SOD活性降低，MDA含量升高，Nrf2、HO-1表達增強，說明存在明顯的氧化應激反應，且Nrf2/ARE通路被激活。
　　2.富氫液可降低糖尿病大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮及尿蛋白水平，并降低腎組織MDA含量，提高GSH水平、SOD活性，上調(diào)Nrf2、HO-1的表達，表明富氫液對腎臟具有一定的保護作用，其機制可能與激活Nrf2/ARE通路，減輕氧化應激損