不同療程高壓氧治療對腦出血大鼠血腫周圍AQP4和SOD表達的影響.pdf

1、目的：高壓氧（Hyperbaric oxygen，HBO）治療是指在高于當(dāng)?shù)貕毫Φ沫h(huán)境中，吸入高于當(dāng)?shù)卮髿庋鯘舛鹊难鮼碇委熂膊〉霓k法。一般在空氣加壓艙內(nèi)通過面罩或類似的其他裝置吸純氧（氧濃度大于95％），或者是在氧氣加壓艙內(nèi)直接呼吸氧艙內(nèi)的氧氣。也就是患者在空氣加壓艙（或者氧氣加壓艙）內(nèi)吸入純氧，利用氧的物理、化學(xué)、生物及生理作用而達到治療疾病的目的，就是HBO治療。腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是指

2、腦實質(zhì)內(nèi)原發(fā)的、非外傷性的出血，比重大約占急性腦血管病種的20%-30%，手術(shù)減壓已成為公認(rèn)的挽救 ICH急性期患者生命最重要的急救手段。然而在如何改善手術(shù)前后缺血、缺氧以及腦水腫等方面的治療仍然見效甚微。而腦水腫是ICH后，引起的繼發(fā)性病理過程，腦水腫會進一步加重腦損傷，所以對腦水腫進行有效防治是促進神經(jīng)功能恢復(fù)、降低繼發(fā)性腦損害的重要和有效舉措，因而減輕腦水腫已經(jīng)成為臨床上治療ICH的重要環(huán)節(jié)。在大量臨床研究中可見ICH后HBO治療

3、可減輕腦水腫，提高血氧張力和彌散距離幫助缺血半暗帶保持活力，有利于其恢復(fù)功能，消除或改善功能障礙，減少后遺癥。但目前尚缺乏循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一種細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白其與細(xì)胞的水通透性密切相關(guān)，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)有13種 AQPs。其中在腦內(nèi)表達最多的 AQP是 AQP4，于室管膜細(xì)胞外側(cè)基膜及星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面等廣泛存在。在腦水腫形成和消除及其病理生理過程中都發(fā)揮了非常重要的作用，調(diào)節(jié)其在腦內(nèi)的表達

4、對研究腦水腫的治療具有重要的臨床意義。基礎(chǔ)研究表明，HBO可通過抑制腦出血后出血灶周圍AQP4表達的水平，進而減輕 ICH后腦水腫形成。且有研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)過量自由基會對細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)造成損傷，誘發(fā)細(xì)胞組織DNA突變，進而引發(fā)、加重人體多種疾患。而人體中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）水平與自由基含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的對應(yīng)關(guān)系，通過對SOD的檢測，可以間接反映得到體內(nèi)自由基的含量大?。籋BO能夠提高機體SOD含

5、量水平，且SOD對免除自由基損傷、平衡機體氧化與抗氧化系統(tǒng)有至關(guān)重要作用。研究小組在前期實驗中表明，腦出血大鼠治療最佳治療高壓氧治療壓力是2.0ATA（Atmosphere absolute，ATA）；腦出血后6小時是最佳介入時間，治療吸氧時間是60min。本文主要對不同療程HBO治療對ICH后大鼠血腫周圍水通道蛋白（Aquaporin-4，AQP4）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）表達的影響進行研究

6、，從而就最佳 ICH后高壓氧治療的療程進行探討。
　　方法：⑴實驗動物分組：52只雄性SD大鼠（按評分將未達標(biāo)準(zhǔn)的大鼠剔除），體重控制在250g~285g，飼養(yǎng)在河北醫(yī)大二醫(yī)院的神經(jīng)病學(xué)實驗室動物房內(nèi)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂食，飲用實驗室內(nèi)自來水。動物由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購買。模型成功后，對52只SD大鼠進行隨機分組，區(qū)分為正常組（12只）、實驗組（20只）和對照組（20只）。實驗組大鼠根據(jù)高壓氧治療療程不同區(qū)分為4個亞組：1周組、

7、2周組、3周組和4周組，每組5只大鼠。實驗組中各組大鼠分別在對應(yīng)高壓氧治療周期結(jié)束后斷頭取腦保留部分腦組織留取標(biāo)本；正常組（每個亞組3只）和對照組（每個亞組5只腦出血大鼠）飼養(yǎng)在正常環(huán)境中，不予任何干預(yù)措施，處死時間與實驗組相同，之后留存標(biāo)本。⑵腦出血動物模型制備：向大鼠右側(cè)尾殼核內(nèi)定位注射Ⅶ型膠原酶制備ICH模型。⑶神經(jīng)功能的評定:在大鼠腦出血模型制備之后6小時，觀察大鼠行為學(xué)及神經(jīng)功能缺損評分方法進行神經(jīng)功能缺損評分。按 Longa

8、FZ評分法法則進行評分：0分，無神經(jīng)功能缺陷體征；1分，進針對側(cè)肢體（左側(cè)）不能完全伸展（為輕度局灶神經(jīng)功能缺損）；2分，向進針對側(cè)轉(zhuǎn)圈，進針對側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象（為中度局灶神經(jīng)功能缺損）；3分，向進針對側(cè)傾倒，不能站立（為重度局灶神經(jīng)功能缺損）；4分，不能自發(fā)行走，昏睡等意識障礙。2分以上認(rèn)為造模成功。⑷高壓氧治療：與術(shù)后6h對制備的模型大鼠進行評分，選擇評分為2分以上的實驗組大鼠。將動物放置于特制的木箱中，將木箱置于煙臺冰輪高壓

9、氧艙內(nèi)，壓力設(shè)定為2.0ATA，加壓30min，穩(wěn)壓前5min采用直排式給動物箱內(nèi)充氧，氧流量設(shè)定為10L/min（穩(wěn)壓時測得木箱排氣口氧濃度可達85%），穩(wěn)壓吸氧時間60min，然后減壓20min出艙，結(jié)束治療，1次/d。每周7次，根據(jù)實驗分組分別治療（1周、2周、3周、4周）。⑸AQP4測定：各組大鼠于腦出血后相應(yīng)時間點處死取腦，經(jīng)腦表面穿刺點冠狀面切開標(biāo)本，取穿刺點后3mm厚腦組織制備石蠟切片，采用免疫組化法觀察AQP4的表達，陽

10、性細(xì)胞為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿呈棕黃色。采用Image Pro Plus6.0全自動圖像分析系統(tǒng)，測每高倍鏡（10*40倍）視野內(nèi)AQP4的吸光度，每只大鼠選擇2張腦組織切片，每張切片選5個不同的視野，計算各組的平均光密度值（OD）。SOD測定：各組大鼠在相應(yīng)時間點，處死取腦，取血腫周圍腦組織液氮冷卻，放-80℃冰箱保存，批量測定結(jié)果。測定時稱重，加0.86%生理鹽水配制，并用超聲粉碎儀粉碎細(xì)胞，再離心（4000r/min）5-8min，取上清

11、，按照使用說明書檢測吸光度（OD）。⑹實驗結(jié)果采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（x―±s），應(yīng)用 t檢驗進行兩組間的比較，應(yīng)用 ANOVA對多組間的計量資料均數(shù)進行方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：①腦組織水含量測定的結(jié)果：與正常組相比，對照組1周末含水量開始增加，第2周達高峰、第3周逐漸下降，第4周基本恢復(fù)至正常水平。對照組第1周、第2周、第3周腦組

12、織含水量均高于正常組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。第4周腦組織含水量與正常組相比差異不明顯（P>0.05）。對照組組內(nèi)比較：除第1周和第4周之間差異不明顯外（P>0.05），其余各亞組之間相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。實驗組各時間點腦組織水含量變化趨勢與對照組一致，但較對照組相比均有降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。4個亞組之間腦組織水含量雖然從數(shù)據(jù)上看每個時間點數(shù)值都有變化，但除了第1周、第3周、第4周與第2周相

13、比均有差異（P<0.05）外，該三組之間差異不明顯（P>0.05）詳見Table1。②大鼠腦組織AQP4表達的變化：與正常組相比，對照組大鼠在腦出血后第1周末AQP4表達開始增加，第2周達到頂峰，第3周開始逐漸下降，第4周基本恢復(fù)至正常水平。對照組第1周、第2周、第3周的腦組織 AQP4的表達均高于正常組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組第4周腦組織 AQP4的表達與正常組相比差異不明顯（P>0.05）。對照組中四個亞組之間相

14、比均有統(tǒng)計學(xué)差異（ P<0.05）。實驗組各時間點AQP4表達變化趨勢與對照組相一致，且較對照組相比均有所降低。且在第1周、第2周、第3周差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但在第4周實驗組與對照組之間差異不明顯（P>0.05）。實驗組4個亞組之間AQP4表達雖然在數(shù)據(jù)上看每個時間點數(shù)值均有變化，但第1周與第3周之間相比差異較小，無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但該兩組與第2周及第4周之間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）詳見Table

15、2。③大鼠腦組織SOD表達的變化：高等動物細(xì)胞內(nèi)只有兩種SOD（Cu-ZnSOD、Mn-SOD）兩者相加即為總SOD（T-SOD）。實驗中經(jīng)樣本前處理過的樣本中Mn-SOD活力喪失，但Cu-ZnSOD活力不變。T-SOD：與正常組相比，對照組T-SOD表達在前3周均增加，第2周表達達高峰，第4周表達活性下降至正常水平。對照組1周、2周、3周的T-SOD均高于正常組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組第4周T-SOD與正常組相比差

16、異不明顯（P>0.05）。對照組內(nèi)相比：1-3周各組之間相比無差異（P>0.05），但與第4周相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。實驗組各時間點SOD表達變化趨勢與對照組一致，但較對照組相比均有增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實驗組4個亞組之間SOD表達，雖然從數(shù)據(jù)上看每個時間點數(shù)值都有變化，但除了第1周、第2周、第3周與第4周相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）外，該3組之間相比無差異（P>0.05）；Cu-ZnSOD：與正常

17、組相比，對照組Cu-ZnSOD表達均增加，第3周表達最多。對照組各亞組的Cu-ZnSOD表達活性均高于正常組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組相比：對照組各亞組之間相比無差異（P>0.05）。實驗組各時間點Cu-ZnSOD表達變化趨勢與對照組一致，但較對照組相比均有增加，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。雖然從數(shù)據(jù)上看每個時間點數(shù)值都有變化，但4個亞組之間相比差異不明顯（P>0.05）。
　　結(jié)論：通過膠原酶誘導(dǎo)建立