靶向人fgl2的腺病毒微小RNA在肝癌的體內(nèi)、外干預(yù)研究.pdf

1、目的：
　　纖維蛋白原樣蛋白2(Fibrinogen-like protein2/fibroleukin)又稱纖維介素，有膜型和分泌型兩種形式，mfgl2(membrane fgl2)主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等表面,可催化凝血酶原為凝血酶，從而參與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程中。本實(shí)驗(yàn)室成功合成靶向人fgl2的腺病毒微小RNA（Ad-hfgl2-miRNA），本研究旨在探討其對(duì)人腫瘤細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步進(jìn)行肝癌裸鼠皮下

2、荷瘤的體內(nèi)干預(yù)研究。
　　方法：
　　1.流式檢測(cè)人正常肝細(xì)胞LO2、肝癌細(xì)胞LM3、宮頸癌細(xì)胞Hela、鼻咽癌細(xì)胞CNE和大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH460表面hfgl2和柯薩奇-腺病毒受體（coxsackie and adenovirus receptor CAR）表達(dá)；
　　2.采用Western-Blot檢測(cè)Ad-hfgl2-miRNA對(duì)fgl2蛋白干預(yù)作用；
　　3.確定Ad-hfgl2-miRNA感染人腫瘤

3、細(xì)胞的最適感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）；
　　4. CCK-8法檢測(cè)Ad-hfgl2-miRNA對(duì)LM3、Hela、CNE和NCIH460細(xì)胞增殖的影響；
　　5.將人肝癌細(xì)胞LM3接種于裸小鼠皮下，建立皮下移植瘤模型，將瘤體積達(dá)到約100mm3的荷瘤鼠隨機(jī)分組，分別行瘤內(nèi)注射高、中、低劑量（3.3*1010IU、1.0*1010IU、3.3*109IU）Ad-hfgl2-miRN

4、A及非相關(guān)對(duì)照腺病毒，6天干預(yù)1次，共干預(yù)3次，干預(yù)期間測(cè)量瘤體大小，計(jì)算腫瘤體積、相對(duì)腫瘤體積及相對(duì)腫瘤增殖率。
　　結(jié)果：
　　1.流式檢測(cè)hfgl2在人正常肝細(xì)胞LO2幾乎不表達(dá)，在人腫瘤細(xì)胞LM3、Hela、CNE和NCIH460細(xì)胞表面均有表達(dá)，靜息狀態(tài)下表達(dá)fgl2的Hela細(xì)胞陽(yáng)性率為12％，不同濃度TNF-α刺激下其fgl2表達(dá)水平不同，在40ng/ml濃度下表達(dá)水平最高，可達(dá)到25%；靜息狀態(tài)下表達(dá)fgl2

5、的LM3、CNE、NCIH460細(xì)胞陽(yáng)性率分別為15%、19.1%、15.9%。
　　2.WB結(jié)果表明Ad-hfgl2-miRNA對(duì)目的蛋白fgl2表達(dá)有抑制效應(yīng)。
　　3.Ad-hfgl2-miRNA感染LM3、Hela、CNE和NCIH460細(xì)胞最適MOI值分別是200、50、100、100。
　　4.CCK-8法表明不同濃度Ad-hfgl2-miRNA對(duì)LM3、Hela、CNE和NCIH460細(xì)胞均有增殖抑制作用

6、，并表現(xiàn)出劑量依賴性，和陰性對(duì)照相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.建立人肝癌LM3裸小鼠移植瘤模型，干預(yù)第10天時(shí)，高、中、低劑量（3.3*1010IU、1.0*1010IU、3.3*109IU）干預(yù)組平均腫瘤體積均小于非相關(guān)對(duì)照組，分別為523.0±44.19 mm3 VS1042±138.8 mm3，P<0.05；546.5±22.41 mm3 VS1042±138.8 mm3，P<0.05;622.4±82.93 mm3

7、VS1042±138.8 mm3，P<0.05），此后每個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)，各個(gè)干預(yù)組的平均腫瘤體積均小于對(duì)照組，至治療第19天，腫瘤體積分別為307.2±22.30 mm3 VS2351±593.7 mm3，P<0.01；704.4±60.18 mm3 VS2351±593.7 mm3，P<0.01；1042±50.07mm3 VS2351±593.7mm3，P<0.05；在治療第10天、13天、16天、19天時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，高、中劑量（3.

8、3*1010IU、1.0*1010IU）干預(yù)組的相對(duì)腫瘤體積均顯著小于對(duì)照組，低劑量干預(yù)組（3.3*109IU）和對(duì)照組無(wú)顯著差異。在治療第16天，高、中、低劑量組的相對(duì)腫瘤抑制率分別為24.5%、54.7%、101.1%，第19天時(shí)相應(yīng)各組相對(duì)腫瘤抑制率分別為15%、32.7%、64.5%，其中從第16天開(kāi)始，高劑量（3.3*1010IU）干預(yù)組的相對(duì)腫瘤抑制率均小于40%，干預(yù)效果顯著。結(jié)果顯示Ad-hfgl2-miRNA對(duì)HCCL