非復(fù)制型腺病毒攜帶制備的人纖維介素微小RNA在肝癌的體內(nèi)、外效應(yīng)研究.pdf

1、【背景/目的】
　　纖維蛋白原樣蛋白2[Fibrinogen-like protein2(fgl2)/fibroleukin]（FGL2），也稱為纖維介素、fgl2凝血酶原酶，屬于纖維蛋白原相關(guān)蛋白超家族成員中的一員，具有絲氨酸酶的活性。fgl2有跨膜型和可溶型兩種存在形式。跨膜型fgl2主要分布在腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面，通過91位絲氨酸位點，裂解凝血酶原酶生成凝血酶，一方面將纖維蛋白原催化交聯(lián)形成纖維蛋白，為腫瘤生

2、長提供支架，另一方面通過蛋白酶激活受體（protease-activated receptors,PARs），傳遞MAPK/ERK信號，促進(jìn)相應(yīng)細(xì)胞的增殖和炎性因子、促血管生成因子的分泌。我們前期研究已成功構(gòu)建攜帶自行制備的人纖維介素微小RNA的非復(fù)制型腺?。ˋd-hfgl2-miRNA），本研究旨在研究Ad-hfgl2-miRNA對人肝癌細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)而進(jìn)行Ad-hfgl2-miRNA干預(yù)裸小鼠人肝癌皮下移植瘤的體內(nèi)效應(yīng)研究。

3、r>　　【方法】
　　1.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測人肝癌細(xì)胞系LM3、Huh7和PLC的hfgl2表達(dá)。
　　2.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測LM3、Huh7和PLC細(xì)胞腺病毒受體（coxsackie and adenovirus receptor，CAR）表達(dá)。
　　3.不同濃度腺病毒感染LM3、Huh7、PLC細(xì)胞，確定其感染這三種細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，采用Western

4、-Blot方法檢測hfgl2蛋白的表達(dá)。
　　4.采用CCK-8試劑盒法檢測Ad-hfgl2-miRNA對LM3、Huh7、PLC細(xì)胞增殖的影響。
　　5.建立HCCLM3裸小鼠人肝癌皮下移植瘤模型，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100-150 mm3時，將裸鼠隨機分為三個組，干預(yù)組采用瘤內(nèi)注射1×109IU Ad-hfgl2-miRNA腺病毒顆粒，陰性對照組、空白組分別注射1×109IU Ad-neg-miRNA和相同體積PBS，每周干

5、預(yù)一次，一共四次，每2-3天測量一次腫瘤的大小直到治療終點，并計算腫瘤體積、相對腫瘤體積及相對腫瘤增殖率。
　　6.治療終點時，剝離腫瘤稱重，收集瘤組織進(jìn)行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和Western blot實驗，檢測腫瘤組織中hfgl2蛋白和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD31分子的表達(dá)，并計算瘤組織中微血管密度MVD。
　　【結(jié)果】
　　1.流式細(xì)胞術(shù)檢測hfgl2在 LM3、Huh7、PLC三種人肝癌細(xì)胞均有表達(dá)，表達(dá)

6、hfgl2的LM3、Huh7、PLC細(xì)胞分別為17.3％、55.4%和28.5%。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測表達(dá)CAR的LM3、Huh7、PLC細(xì)胞分別為7.7%、11.6%和7.3%，在三種人肝癌細(xì)胞株中CAR低表達(dá)。
　　3.腺病毒感染LM3、Huh7、PLC細(xì)胞最佳感染復(fù)數(shù)分別為200、400、200；在細(xì)胞水平，Ad-hfgl2-miRNA對目的蛋白hfgl2具有明顯的抑制效應(yīng)。
　　4. CCK-8實驗表明：不

7、同MOI的Ad-hfgl2-miRNA腺病毒顆粒感染LM3、Huh7、PLC細(xì)胞，對細(xì)胞的增殖具有顯著地抑制作用，并且抑制率呈劑量依賴關(guān)系，與陰性對照相比，Ad-hfgl2-miRNA具有更強的抑制作用，二者比較有統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果表明，干預(yù)hfgl2基因可以抑制LM3、Huh7、PLC細(xì)胞的增殖。
　　5.成功建立了HCCLM3裸小鼠人肝癌皮下移植瘤模型，干預(yù)第10天時，干預(yù)組平均腫瘤體積小于非相關(guān)對照和空白對照組（147.7

8、8±46.32mm3vs333.93±100.58mm3，P<0.01；147.78±46.32mm3vs479.45±106.56mm3，P<0.01）；治療第23天時，干預(yù)組和非相關(guān)對照、空白對照組相比，腫瘤體積仍顯著減?。?01.68±111.01mm3vs814.4±419.7mm3，P<0.05；201.68±111.01mm3vs1246.35±394.08mm3，P<0.05）；治療終點時，干預(yù)組、非相關(guān)對照和空白對照組平

9、均腫瘤重量分別為0.069g±0.018g、0.496g±0.213g和0.564g±0.147g，干預(yù)組腫瘤的重量小于非相關(guān)對照和空白對照組（P<0.05）。結(jié)果顯示Ad-hfgl2-miRNA對HCCLM3裸小鼠人肝癌皮下瘤的生長具有顯著地抑制作用。
　　6.Western blot結(jié)果顯示：干預(yù)組和非相關(guān)對照、空白對照組相比，腫瘤組織中hfgl2蛋白表達(dá)明顯減少。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：干預(yù)組和對照組相比，血管新生標(biāo)志物CD3

10、1表達(dá)明顯降低。結(jié)果表明瘤內(nèi)注射Ad-hfgl2-miRNA可顯著下調(diào)hfgl2蛋白的表達(dá)，減少腫瘤血管新生，從而抑制人肝癌皮下移植瘤的生長。
　　【結(jié)論】
　　1. Ad-hfgl2-miRNA腺病毒顆粒對人肝癌細(xì)胞LM3、Huh7、PLC具有顯著地增殖抑制作用。
　　2.攜帶hfgl2 RNA干擾序列的非復(fù)制型腺病毒可有效的下調(diào)hfgl2蛋白的表達(dá)，減少腫瘤血管新生，抑制腫瘤的生長。為臨床藥物的開發(fā)和肝癌治療提供了