非復制型腺病毒攜帶制備的人纖維介素微小RNA在肝癌的體內、外效應研究.pdf

1、【背景/目的】
　　纖維蛋白原樣蛋白2[Fibrinogen-like protein2(fgl2)/fibroleukin]（FGL2），也稱為纖維介素、fgl2凝血酶原酶，屬于纖維蛋白原相關蛋白超家族成員中的一員，具有絲氨酸酶的活性。fgl2有跨膜型和可溶型兩種存在形式。跨膜型fgl2主要分布在腫瘤細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞表面，通過91位絲氨酸位點，裂解凝血酶原酶生成凝血酶，一方面將纖維蛋白原催化交聯(lián)形成纖維蛋白，為腫瘤生

2、長提供支架，另一方面通過蛋白酶激活受體（protease-activated receptors,PARs），傳遞MAPK/ERK信號，促進相應細胞的增殖和炎性因子、促血管生成因子的分泌。我們前期研究已成功構建攜帶自行制備的人纖維介素微小RNA的非復制型腺病（Ad-hfgl2-miRNA），本研究旨在研究Ad-hfgl2-miRNA對人肝癌細胞增殖的影響，進而進行Ad-hfgl2-miRNA干預裸小鼠人肝癌皮下移植瘤的體內效應研究。

3、r>　　【方法】
　　1.采用流式細胞術檢測人肝癌細胞系LM3、Huh7和PLC的hfgl2表達。
　　2.采用流式細胞術檢測LM3、Huh7和PLC細胞腺病毒受體（coxsackie and adenovirus receptor，CAR）表達。
　　3.不同濃度腺病毒感染LM3、Huh7、PLC細胞，確定其感染這三種細胞的最佳感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，采用Western

4、-Blot方法檢測hfgl2蛋白的表達。
　　4.采用CCK-8試劑盒法檢測Ad-hfgl2-miRNA對LM3、Huh7、PLC細胞增殖的影響。
　　5.建立HCCLM3裸小鼠人肝癌皮下移植瘤模型，當腫瘤體積達到約100-150 mm3時，將裸鼠隨機分為三個組，干預組采用瘤內注射1×109IU Ad-hfgl2-miRNA腺病毒顆粒，陰性對照組、空白組分別注射1×109IU Ad-neg-miRNA和相同體積PBS，每周干

5、預一次，一共四次，每2-3天測量一次腫瘤的大小直到治療終點，并計算腫瘤體積、相對腫瘤體積及相對腫瘤增殖率。
　　6.治療終點時，剝離腫瘤稱重，收集瘤組織進行組織學、免疫組織化學和Western blot實驗，檢測腫瘤組織中hfgl2蛋白和新生血管內皮細胞的表面標志物CD31分子的表達，并計算瘤組織中微血管密度MVD。
　　【結果】
　　1.流式細胞術檢測hfgl2在 LM3、Huh7、PLC三種人肝癌細胞均有表達，表達

6、hfgl2的LM3、Huh7、PLC細胞分別為17.3％、55.4%和28.5%。
　　2.流式細胞術檢測表達CAR的LM3、Huh7、PLC細胞分別為7.7%、11.6%和7.3%，在三種人肝癌細胞株中CAR低表達。
　　3.腺病毒感染LM3、Huh7、PLC細胞最佳感染復數(shù)分別為200、400、200；在細胞水平，Ad-hfgl2-miRNA對目的蛋白hfgl2具有明顯的抑制效應。
　　4. CCK-8實驗表明：不

7、同MOI的Ad-hfgl2-miRNA腺病毒顆粒感染LM3、Huh7、PLC細胞，對細胞的增殖具有顯著地抑制作用，并且抑制率呈劑量依賴關系，與陰性對照相比，Ad-hfgl2-miRNA具有更強的抑制作用，二者比較有統(tǒng)計學差異。以上結果表明，干預hfgl2基因可以抑制LM3、Huh7、PLC細胞的增殖。
　　5.成功建立了HCCLM3裸小鼠人肝癌皮下移植瘤模型，干預第10天時，干預組平均腫瘤體積小于非相關對照和空白對照組（147.7

8、8±46.32mm3vs333.93±100.58mm3，P<0.01；147.78±46.32mm3vs479.45±106.56mm3，P<0.01）；治療第23天時，干預組和非相關對照、空白對照組相比，腫瘤體積仍顯著減小（201.68±111.01mm3vs814.4±419.7mm3，P<0.05；201.68±111.01mm3vs1246.35±394.08mm3，P<0.05）；治療終點時，干預組、非相關對照和空白對照組平

9、均腫瘤重量分別為0.069g±0.018g、0.496g±0.213g和0.564g±0.147g，干預組腫瘤的重量小于非相關對照和空白對照組（P<0.05）。結果顯示Ad-hfgl2-miRNA對HCCLM3裸小鼠人肝癌皮下瘤的生長具有顯著地抑制作用。
　　6.Western blot結果顯示：干預組和非相關對照、空白對照組相比，腫瘤組織中hfgl2蛋白表達明顯減少。免疫組織化學結果顯示：干預組和對照組相比，血管新生標志物CD3

10、1表達明顯降低。結果表明瘤內注射Ad-hfgl2-miRNA可顯著下調hfgl2蛋白的表達，減少腫瘤血管新生，從而抑制人肝癌皮下移植瘤的生長。
　　【結論】
　　1. Ad-hfgl2-miRNA腺病毒顆粒對人肝癌細胞LM3、Huh7、PLC具有顯著地增殖抑制作用。
　　2.攜帶hfgl2 RNA干擾序列的非復制型腺病毒可有效的下調hfgl2蛋白的表達，減少腫瘤血管新生，抑制腫瘤的生長。為臨床藥物的開發(fā)和肝癌治療提供了