抑制COX-2加重輻射所致小鼠結(jié)腸間充質(zhì)干細(xì)胞損傷.pdf

1、目的：
　　本課題以腸組織MSCs為中心，試圖通過建立腸組織MSCs體外分離培養(yǎng)技術(shù)，探究COX-2抑制劑對(duì)MSCs輻射損傷的影響，以及COX-2抑制劑對(duì)輻射所致小鼠組織損傷的影響。為抗輻射防護(hù)劑的研發(fā)提供新的思路和理論依據(jù);同時(shí)，為臨床合理用藥提供基礎(chǔ)理論參考。
　　方法：
　　1.小鼠結(jié)腸MSCs分離、培養(yǎng)
　　通過兩步消化法，從C57BL/6小鼠結(jié)腸組織中分離出MSCs，并在低糖培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)。

2、>　　2.細(xì)胞鑒定
　　顯微觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)特征;采用流式細(xì)胞術(shù)(fluorescence activated cellsorting，F(xiàn)ACS)檢測(cè)細(xì)胞表型;采用免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry，ICC)、蛋白免疫印跡(western blot，WB)以及FACS技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞COX-2表達(dá);CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性;利用體外誘導(dǎo)分化技術(shù)，分析細(xì)胞分化潛能;同時(shí)，采用Real-timePCR技術(shù)對(duì)細(xì)胞

3、的干性相關(guān)基因進(jìn)行初步檢測(cè)分析。
　　3.藥物濃度篩選
　　用不同濃度梯度的阿司匹林和塞來昔布預(yù)處理體外培養(yǎng)的小鼠結(jié)腸組織間充質(zhì)干細(xì)胞(colonic mesenchymal stem cells，cMSCs)，24 h后采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，篩選合理的藥物濃度用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　4.COX-2抑制劑對(duì)小鼠cMSCs中COX-2表達(dá)的影響
　　用篩選得到的合理劑量的阿司匹林和塞來昔布預(yù)處理cMSCs

4、，分別于24 h和48h后，采用WB技術(shù)對(duì)各處理組COX-2表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　5.建立細(xì)胞輻照模型
　　(1)不同劑量電離輻射對(duì)cMSCs增殖活性的影響
　　用不同劑量的60Co-γ射線刺激cMSCs，輻照后24 h，采用CCK-8法檢測(cè)各處理組細(xì)胞增殖活性，篩選合理的輻照劑量用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　(2)輻照后，不同時(shí)間點(diǎn)cMSCs增殖活性改變
　　用篩選得到的合適的輻照劑量刺激小鼠cMSCs，分別

5、于輻照后6、24、48和72h，采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性，篩選合理的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。
　　6.COX-2抑制劑對(duì)cMSCs輻射損傷的影響
　　用阿司匹林（75μmol/L）和塞來昔布（20μmol/L）預(yù)處理小鼠cMSCs，24 h后給予細(xì)胞15 Gy60Co-γ射線輻照刺激，輻照后24 h，采用CCK-8法對(duì)各處理組細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　7.COX-2抑制劑對(duì)輻射后小鼠組織的影

6、響
　　分別對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥2w，同時(shí)采用60Co-γ射線對(duì)小鼠進(jìn)行全身輻照處理，并對(duì)各處理組動(dòng)物組織損傷改變進(jìn)行觀察分析。
　　結(jié)果：
　　一、小鼠cMSCs分離培養(yǎng)與鑒定
　　1.細(xì)胞基本特征
　　經(jīng)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為成纖維細(xì)胞狀，且傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生改變。
　　2.所分離培養(yǎng)的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD29和CD44表型分子
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，培

7、養(yǎng)到第三代的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)CD29和CD44兩種常見的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，其中，CD29分子陽性的細(xì)胞占(97.48±1.18)％，CD44分子陽性的細(xì)胞達(dá)到(91.18±1.97)％。
　　3.所分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有一定的增殖能力
　　采用CCK-8法對(duì)培養(yǎng)三代以后的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖呈上升趨勢(shì)。
　　4.所分離培養(yǎng)的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細(xì)胞具有一定的分

8、化能力
　　對(duì)培養(yǎng)三代以后的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，結(jié)果顯示，經(jīng)一段時(shí)間培養(yǎng)后，該細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。
　　5.所分離培養(yǎng)的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)Bmi1和Lrig1干性基因
　　采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)細(xì)胞干性基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該細(xì)胞可能表達(dá)Bmi1和Lrig1干性基因。
　　6.所分離培養(yǎng)的小鼠cMSCs表達(dá)COX-2
　　ICC、WB以及FACS檢測(cè)結(jié)果顯示

9、，cMSCs表達(dá)COX-2。
　　二、阿司匹林和塞來昔布對(duì)正常體外培養(yǎng)的小鼠cMSCs的影響
　　1.不同濃度阿司匹林和塞來昔布對(duì)正常體外培養(yǎng)的小鼠cMSCs細(xì)胞活性的影響
　　CCK-8結(jié)果顯示，阿司匹林在最高濃度為100μM的范圍內(nèi)沒有對(duì)cMSCs產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用(P=1.000);與正常未給藥組相比，20μM塞來昔布給藥組的細(xì)胞活力未出現(xiàn)明顯改變[（94.58±7.04）％vs（100.00±6.01）％，

10、P=1.000]。
　　2.阿司匹林和塞來昔布對(duì)細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響
　　WB檢測(cè)結(jié)果顯示，75μM阿司匹林和20μM塞來昔布預(yù)處理后，cMSCs中COX-2表達(dá)未出現(xiàn)明顯改變。
　　三、鈷60-γ射線輻照對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠cMSCs的影響
　　1.不同劑量鈷60-γ射線輻照對(duì)cMSCs的影響
　　CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，鈷60-γ射線對(duì)cMSCs具有一定的增殖抑制作用。與正常對(duì)照組相比，15Gy輻照組細(xì)

11、胞增殖率顯著降低[（86.98±6.61）％vs（100.00±4.53）％，P＜0.01]。
　　2.輻照后，不同時(shí)間點(diǎn)小鼠cMSCs損傷改變
　　CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，輻照后6 h cMSCs增殖活性未發(fā)生明顯改變[（95.62±4.57）％vs（100.00±1.53）％，P＞0.05];但是24 h后細(xì)胞增殖率顯著下降[（89.90±2.16）％vs（100.00±1.53）％，P＜0.01]，然

12、而，隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖未出現(xiàn)明顯的進(jìn)一步下降趨勢(shì)(P＞0.05)。
　　四、 COX-2抑制劑對(duì)cMSCs輻射損傷的影響
　　CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，輻照后，體外培養(yǎng)的小鼠cMSCs細(xì)胞增殖顯著抑制[（90.22±1.70）％vs（100.00±5.37）％，P=0.012];給予阿司匹林預(yù)處理后，細(xì)胞輻射損傷未出現(xiàn)明顯加重[（86.67±4.94）％vs（90.22±1.70）％，P=0.321

13、];但是，與輻照組相比，輻照+塞來昔布組細(xì)胞增殖顯著降低[（80.86±0.96）％vs(90.22±1.70)％,P=0.025]。
　　五、 COX-2抑制劑對(duì)輻射后小鼠腸道的影響
　　HE染色結(jié)果顯示，全身輻照后，各處理組小鼠腸組織病理未見明顯差異;TUNEL染色結(jié)果顯示，給處理組之間腸組織細(xì)胞凋亡沒有出現(xiàn)明顯改變。同時(shí)，輻照后，各處理組小鼠腸組織隱窩生存情況亦未見明顯改變。提示所給劑量的阿司匹林和塞來昔布未加重輻射后

14、小鼠腸道損傷。
　　六、 COX-2抑制劑對(duì)輻射后小鼠胸腺和脾臟的影響
　　與對(duì)照組相比，低劑量(4 Gy)輻照組小鼠的胸腺臟器系數(shù)在輻照后3.5 d顯著降低[(34.11±5.74)％vs(100.00±16.37)％，P＜0.01]，提示胸腺損傷;同時(shí)，輻照后，小鼠出現(xiàn)明顯的脾損傷，主要表現(xiàn)為脾臟器系數(shù)下降[(35.30±4.71)％ vs(100.00±10.30)％,P＜0.01]。
　　與低劑量輻照組相比，高

15、劑量(8Gy)輻照組小鼠的胸腺臟器系數(shù)在5.5 d時(shí)降低幅度更大[(13.19±1.96)％vs(40.40±13.46)％]，但兩種輻照劑量組之間脾臟器系數(shù)在5.5 d時(shí)降低程度相近[(30.28±1.13)％vs(31.20±1.17)％];高劑量輻照后第7d，輻照組小鼠胸腺臟器系數(shù)較5.5 d時(shí)有所升高[(34.03±8.40)％vs(13.19±1.95)％]，此外，脾臟器系數(shù)亦有所升高[(37.32±2.10)％vs(30.2

16、8±1.13)％]。
　　與對(duì)照組相比，藥物預(yù)處理后，小鼠胸腺和脾臟器系數(shù)均未顯著降低。
　　七、 COX-2抑制劑對(duì)輻射后小鼠骨髓的影響
　　HE染色結(jié)果顯示，全身輻照后，小鼠出現(xiàn)明顯的骨髓抑制。與對(duì)照組相比，輻照組小鼠骨髓中細(xì)胞明顯減少，同時(shí)空泡明顯增多;進(jìn)一步的TUNEL染色結(jié)果顯示，輻照后C57BL/6小鼠骨髓中凋亡細(xì)胞顯著增多。
　　與對(duì)照組相比，藥物預(yù)處理組小鼠骨髓組織并未發(fā)生明顯的病理損傷改變。

17、r>　　結(jié)論：
　　1.我們成功建立了腸組織MSCs體外分離培養(yǎng)方法;
　　2.小鼠cMSCs表達(dá)COX-2;
　　3.鈷60-γ射線可造成cMSCs損傷;
　　4.COX-2選擇性抑制劑塞來昔布可加重cMSCs輻射損傷;
　　5.阿司匹林(15mg/kg/d)和塞來昔布（60mg/kg/d）對(duì)正常C57BL/6小鼠的胸腺、脾臟、骨髓和腸組織無明顯的損傷作用;
　　6.鈷60-γ射線(4、8Gy)全身