甲烷對(duì)大鼠一氧化碳中毒腦損傷保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、一氧化碳(carbon monoxide，CO)是一種無(wú)色、無(wú)味、無(wú)刺激性的有毒氣體，分子量為28，主要來(lái)源于含碳化合物的不完全燃燒。在大氣中，正常的CO濃度不超過(guò)0.001％，而0.1％濃度的CO足以致人死亡。目前，CO是世界上最為常見(jiàn)的人類中毒原因。CO中毒癥狀具有非特異性，輕度CO中毒可表現(xiàn)為頭痛、肌痛、頭暈、惡心、或神經(jīng)心理障礙，而嚴(yán)重的CO中毒則可導(dǎo)致意識(shí)模糊，昏迷甚至死亡。在CO暴露后3天-4周，超過(guò)一半的嚴(yán)重中毒患者會(huì)出現(xiàn)

2、遲發(fā)性神經(jīng)精神癥狀，輕微的癥狀包括人格的改變，輕度認(rèn)知功能損害，嚴(yán)重的癥狀包括嚴(yán)重癡呆，精神錯(cuò)亂，帕金森癥，尿失禁或其他異常癥狀，這些損害被稱作遲發(fā)性神經(jīng)精神后遺癥(delayedneuropsychological sequelae，DNS)。約有50-70％的DNS患者在一年后部分或完全恢復(fù)正常。CO中毒后腦損傷，特別是DNS，給社會(huì)和家庭帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　CO與血紅蛋白具有強(qiáng)大的結(jié)合能力，是氧氣的200倍。CO通過(guò)呼

3、吸進(jìn)入肺泡，擴(kuò)散至循環(huán)系統(tǒng)，與血紅蛋白迅速結(jié)合，形成碳氧血紅蛋白(carboxyhaemoglobin，COHb)。COHb的形成，導(dǎo)致血紅蛋白攜氧能力的下降，引起低氧血癥。CO導(dǎo)致的低氧是腦損傷的關(guān)鍵因素之一，COHb水平高低是判斷CO中毒嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一。然而，數(shù)十年來(lái)，臨床研究發(fā)現(xiàn)，COHb的水平高低與患者癥狀/體征或最終的預(yù)后并非完全一致。
　　研究表明，CO中毒部分病理生理效應(yīng)與缺血再灌注損傷相似，即在缺氧狀態(tài)后通

4、常伴隨再氧合過(guò)程。CO導(dǎo)致的腦組織損傷中，黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)換為黃嘌呤氧化酶，催化黃嘌呤氧化產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜的臘質(zhì)過(guò)氧化作用。在CO暴露腦組織缺氧及再氧合狀態(tài)過(guò)程中，都存在著大量的羥基自由基。同時(shí)，CO中毒大鼠腦組織中，硝基酪氨酸水平增加10倍，進(jìn)一步證實(shí)在CO中毒過(guò)程中，一氧化氮(nitric oxide，NO)和超氧化物大量產(chǎn)生，生成過(guò)氧硝酸鹽。綜上所述，CO暴露導(dǎo)致的

5、腦損傷是自由基的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，即抗氧化系統(tǒng)和氧化應(yīng)激損傷之間平衡的破壞。應(yīng)用抗氧化劑是治療CO中毒后腦損傷的重要策略之一。一些研究小組已經(jīng)通過(guò)應(yīng)用ROS清除劑作為治療手段，如氫氣，硫化氫，依達(dá)拉奉等，得到滿意治療效果。
　　甲烷是最簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物和主要的天然氣能源。過(guò)去認(rèn)為人類機(jī)體不能利用甲烷。近年來(lái)，研究表明，甲烷釋放可能與機(jī)體氧化還原反應(yīng)調(diào)控以及低氧導(dǎo)致的線粒體損傷有關(guān)。在腸系膜、肝臟、心肌等缺血再灌注損傷模型以及糖尿病視

6、網(wǎng)膜病變模型研究中發(fā)現(xiàn)，甲烷具有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)抗氧化、抗炎癥反應(yīng)及抗凋亡等作用。甲烷對(duì)于氧化應(yīng)激損傷具有潛在的保護(hù)作用。
　　在本研究中，我們推測(cè)，甲烷能夠有效保護(hù)CO中毒后腦損傷，改善腦損傷預(yù)后;同時(shí)，對(duì)于甲烷的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　第一部分，甲烷對(duì)于CO中毒后腦損傷保護(hù)效應(yīng)的研究。我們通過(guò)靜態(tài)吸入CO制備CO中毒大鼠模型，應(yīng)用甲烷溶液進(jìn)行處理，通過(guò)水迷宮等行為學(xué)方法觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化;通過(guò)

7、組織病理學(xué)方法，觀察模型大鼠大腦海馬和皮層神經(jīng)元損傷情況。研究結(jié)果顯示，從行為學(xué)觀察，甲烷能夠有效提高CO暴露大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力;從病理學(xué)觀察，在CO暴露后，甲烷處理組較單純CO暴露后大鼠神經(jīng)元形態(tài)相對(duì)完整，Nissl小體保存相對(duì)完整。
　　第二部分至第四部分，我們分別研究了CO中毒后24小時(shí)和第9天，甲烷的抗氧化、抗炎及抗凋亡保護(hù)機(jī)制。應(yīng)用試劑盒分別檢測(cè)CO中毒后24小時(shí)和第9天大鼠海馬和皮層超氧化物歧化酶(superoxid

8、e dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量變化，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法分別檢測(cè)CO中毒后24小時(shí)和第9天大鼠海馬和皮層3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)和8-羥基-2'-脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）的含量變化。應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)CO中毒后24小時(shí)和第9天大鼠海馬和皮層炎癥因子水平的變化，腫瘤壞死因子-α(tumournecro

9、sis factor-α，TNF-α)，白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白介素-6（IL-6）。凋亡指標(biāo)采用TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-endlabelling)和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)方法。結(jié)果顯示，甲烷能夠顯著提高CO中毒后24小時(shí)和第9天大鼠海馬和皮層SOD活性，降低海馬和皮層MDA

10、水平和海馬的3-NT和8-OHdG水平。同時(shí)，甲烷能夠顯著抑制CO中毒后24小時(shí)和第9天模型大鼠海馬和皮層TNF-α和IL-1β等炎癥指標(biāo)水平。在CO暴露后第9天，甲烷顯著能夠減少大鼠海馬和皮層凋亡細(xì)胞數(shù)量以及Caspase-3表達(dá)水平。
　　第五部分，我們分別采用Western Blotting和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)了CO暴露后第9天，

11、大鼠腦組織海馬和皮層核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor2，Nrf-2）及其下游蛋白過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)的蛋白和mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，在CO中毒后第9天，Nrf-2和下游蛋白CAT的表達(dá)受到抑制，而甲烷能夠提高其表達(dá)水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。
　　上述結(jié)果可以得出以下結(jié)論:
　　1.甲烷能夠有效保護(hù)CO暴露導(dǎo)致的腦損傷，改善中毒預(yù)后。